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Aktivität von Monozyten und NK-Zellen bei Covid-19-Patienten

3. Mai 2020 aktualisiert von: Ietto Giuseppe, Università degli Studi dell'Insubria

Untersuchung immunvermittelter Mechanismen bei Patienten, die positiv auf SARS-CoV-2 getestet wurden: Phänotypische und funktionelle Analyse von Monozyten und NK-Zellen im Blut von Patienten, die von Covid 19 betroffen sind

SARS-CoV-2 gehört zur Familie der Beta-Coronaviren und sein Übertragungsweg und seine Symptome folgen denen aller ambulant erworbenen Coronaviren. Der Hauptunterschied des neuartigen Coronavirus ist die höhere Sterblichkeitsrate, die bei etwa 3 % liegt.

Die Sterblichkeitsrate liegt nur bei Patienten über 50 Jahren über 1%, während sie bis zum Alter von 40 Jahren unter 0,4% liegt. Bisher wurden keine Todesfälle bei Kindern unter 10 Jahren gemeldet. Die Sterblichkeitsrate ist bei Männern fast doppelt so hoch wie bei Frauen. Diese altersabhängige Verteilung der Mortalitätsrate infizierter Patienten konnte neben dem hohen Alter nur teilweise auf andere Komorbiditäten zurückgeführt werden. Tatsächlich haben Patienten ohne Vorerkrankungen jedoch eine Sterblichkeitsrate von 0,9 %.

Die nahezu Nullrate schwerer Erkrankungen bei Kindern und allgemein bei Patienten unter 40 Jahren ist völlig unerklärlich. Säuglinge, Kinder und Jugendliche können infiziert werden, aber die Infektion ist schnell selbstlimitierend oder ohne Symptome. Ältere Patienten erleiden schwere Lungenschäden als Folge einer verspäteten Immunantwort.

Eine mögliche Erklärung für diese Phänomene könnte etwas sein, das unabhängig von der Neuartigkeit des Virus selbst die Fähigkeit sicherstellt, bei jüngeren Menschen sofort auf SARS-CoV-2 zu reagieren.

Es scheint so zu sein, dass jüngere Menschen bereits ohne vorherigen Kontakt auf die Antigene des Virus sensibilisiert sind.

Diese Immunität ist nicht wirklich spezifisch, sondern "teilspezifisch" für viele Antigene des Virus, jedoch in der Lage, die Infektion im Organismus einzuschränken. Irgendetwas stimulierte das Immunsystem und es zerstreute die Immunität gegen immer mehr vorhandene Antigene. Kinder sind die Altersgruppe, die allen in der Gemeinschaft zirkulierenden Viren am stärksten ausgesetzt ist.

Diese Immunität ist nicht dauerhaft, sondern lässt nach und nach nach. Es schützt aufgrund seiner langsamen Abnahme vom Alter von zwei Jahren, wenn die hypothetische Stimulation auftritt, bis zum fünften Lebensjahrzehnt.

Die einzigen äußeren Reize, die gesunde Menschen erhalten, sind Impfstoffe. Alle Impfungen und insbesondere Tetanus-, Diphtherie-Toxoide und inaktivierte Bakterien wie Keuchhusten können das Immunsystem stimulieren. Sie entwickeln die spezifische Immunität, erzeugen aber auch eine sprießende Immunität gegen Antigene auf der Durchreise, wie Coronaviren und andere in der Gemeinschaft zirkulierende Viren.

Die entwickelte Immunität bietet einen gewissen Schutz gegen mehrere Virusinfektionen über Jahre bis zum natürlichen Abklingen.

Nach dem fünften Jahrzehnt wird diese Immunität langsamer abgerufen und reaktiviert. Darüber hinaus scheinen Transplantationsempfänger und HIV-infizierte Patienten, deren Immunsystem unerwarteterweise gehemmt ist, nicht die schlimmsten Komplikationen einer SARS-CoV-2-Infektion zu erleiden. Ein Ungleichgewicht des Immunsystems könnte während der Reaktion auf das Virus eine entscheidende Rolle spielen und die zerstörerischen Folgen einer übermäßigen Entzündung begrenzen.

Laut der medizinischen Hypothese, auf der das Protokoll basiert, könnten junge Menschen von einer durch epigenetische Reprogrammierung induzierten funktionellen Anpassung angeborener Immunzellen und insbesondere einer bereits bestehenden „teilspezifischen“ Immunität gegen die Gemeinschaftsviren profitieren, die durch „Bystander“ verursacht werden Wirkung" vorangegangener Impfungen. In dieser Studie werden wir die Hauptunterschiede untersuchen, die bei mit SARS-CoV-2 infizierten Patienten bestehen, die die Krankheit mit unterschiedlichem Schweregrad erleben. Wir nehmen an, verschiedene Populationen von Patienten zu erkennen, jede mit einem spezifischen immunologischen Muster. Es könnte sich in Bezug auf Zytokine, Serumspiegel löslicher Faktoren und Immunzellenaktivität sowohl des angeborenen als auch des erworbenen Kompartiments unterscheiden. Der Nachweis einer Rolle dieser immunologischen Phänomene in der Pathogenese von Covid-19 sind Grundlagen für die Durchführung therapeutischer immunmodulatorischer Behandlungen. Darüber hinaus könnte die Definition eines immunologischen Risikoprofils etablierte Therapien auf jeden Patiententyp zuschneiden.

Studienübersicht

Status

Unbekannt

Bedingungen

Intervention / Behandlung

Detaillierte Beschreibung

Laut der medizinischen Hypothese, auf der das Protokoll basiert, könnten junge Menschen von einer durch epigenetische Reprogrammierung induzierten funktionellen Anpassung angeborener Immunzellen und insbesondere einer bereits bestehenden „teilspezifischen“ Immunität gegen die Gemeinschaftsviren profitieren, die durch „Bystander“ verursacht werden Wirkung" vorangegangener Impfungen. In dieser Studie werden wir die Hauptunterschiede untersuchen, die bei mit SARS-CoV-2 infizierten Patienten bestehen, die die Krankheit mit unterschiedlichem Schweregrad erleben. Wir nehmen an, verschiedene Populationen von Patienten zu erkennen, jede mit einem spezifischen immunologischen Muster. Es könnte sich in Bezug auf Zytokine, Serumspiegel löslicher Faktoren und Immunzellenaktivität sowohl des angeborenen als auch des erworbenen Kompartiments unterscheiden.

Daten werden mit 3 Ansätzen gesammelt:

  • Eine experimentelle Analyse für Gruppen von Patienten, um die angeborene Immunantwort zu untersuchen und die genetischen Profile zu identifizieren.
  • Eine epidemiologische Analyse, um die Impfgeschichte der Patienten zu identifizieren;
  • Eine klinische Analyse zum Nachweis des immunologischen Profils;

Für die spezifische Analyse, um die angeborene Immunantwort zu untersuchen und die genetischen Profile zu identifizieren, werden die Wissenschaftler aus dem peripheren Blut NK-Zellen, Monozyten, CD4- und CD8-T-Zellen beider Gruppen analysieren: Gesunde Patienten (negativ auf SARS-CoV getestet -2) und erkrankten Patienten der Untergruppen (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

Von verschiedenen Patientengruppen werden Blutproben (10-15 ml) in EDTA-Röhrchen gezogen, bei 360 g für 10 Minuten zentrifugiert, um Plasma zu erhalten, das bei -80 °C für die anschließende Analyse auf interessierende Zytokine und Chemokine gelagert wird durch ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 und CXCL10) am Ende der Einschreibung.

Die Zellpellets werden mit PBS auf das Ausgangsvolumen zurückgebracht und 1:1 (v/v) verdünnt und dann einer Dichtegradientenschichtung mit Ficoll Histopaque-1077 bei 500 g für 30 Minuten unterzogen. Die aus dem weißen Ring stammenden peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) werden gesammelt, zweimal in PBS gewaschen und dann für nachfolgende Experimente unter Verwendung eines Durchflusszytometer-Assays (REFF) verwendet. Die In-vitro-Kultur unter Verwendung von PBMCs kann von ex vivo 1 Tag bis zu einigen Tagen variieren, und die Zellen werden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM l-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, gehalten und 100 μg/ml Streptomycin (P/S), bei 37 °C, 5 % CO2.

Zur Durchführung einer Ex-vivo-Phänotypanalyse mit fluoreszenzaktiviertem Zellsortierer (FACS) werden 2,5 x 105 frische Gesamt-PBMCs pro FACS-Röhrchen 30 Minuten lang bei 4 °C mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) wie folgt gefärbt: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Nach der Forward/Side Scatter-Einstellung werden NK-Zellen in zwei Untergruppen von Zellen identifiziert, d. h. als CD3- und CD56dim CD16+-Zellen (CD56dim NK-Zellen, die Hauptuntergruppe, etwa 90 %) und CD3- und CD56bright CD16-/low-Zellen ( CD56bright NK-Zellen, die kleinere Untergruppe, etwa 10 %). Die Expression anderer Marker wird auf beiden Untergruppen von Gated-Cells ausgewertet.

Für die Ex-vivo-FACS-Bewertung der Monozyten-Phänotypanalyse werden 2,5 x 105 frische Gesamt-PBMCs pro FACS-Röhrchen 30 Minuten lang bei 4 °C mit mAbs wie folgt gefärbt: CD45-APC, CD14-FITC und CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Nach der Forward/Side Scatter-Einstellung werden Monozyten in drei Untergruppen eingeteilt, d. h. als CD14+- und CD16-Zellen (die Hauptuntergruppe, etwa 90 %), CD14+ CD16+ (die kleinere Untergruppe, etwa 10 %) und CD14-/niedriges CD16+ (die andere kleinere Teilmenge).

Wir werden auch den Phänotyp für CD4- und CD8-T-Zellen und das CD4/CD8-T-Verhältnis unter Verwendung von 2x105 frischer Gesamt-PBMCs, wie zuvor beschrieben, mit den folgenden mAbs evaluieren: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 sowie regulatorische T (Treg ) Zellen, als CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

PBMCs werden auch in vitro für 4 h mit verschiedenen Arten von Stimuli stimuliert, wie LPS (vom TLR4 erkannt), Poly(I:C) (vom TLR3 erkannt), Poly(I:C) plus IL-2 plus IL-12 und Phorbolmyristatacetat (PMA) plus Ionomycin in Anwesenheit von Monensin und Brefeldin. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der spezifischen Zytokin-/Chemokinproduktion von NK-Zellen und Monozyten mithilfe eines intrazellulären FACS-Assays, wie zuvor beschrieben (REFF). Für NK-Zellen messen wir IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE und CD107a-PE (Degranulationsmarker). Für Monozyten werden wir untersuchen: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (proinflammatorische Marker vom Typ M1) und TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -Typ entzündungshemmender Marker) Bei ausreichender Menge an PBMCs werden weitere funktionelle In-vitro-Tests an NK-Zellen und Monozyten eingerichtet. Insbesondere werden PBMCs auf 4 h NK-Zelldegranulation/zytotoxische Funktion gegenüber der erytroleukämischen K562-Zelllinie untersucht, wobei die Oberfläche von CD107a-PE mit einem zytofluorimetrischen Durchflussassay (REFF) bewertet wird.

Wann immer die Menge an PBMCs ausreicht, werden Monozyten mit Anti-CD14-Mikroperlen mit Magnetseparator und NK-Zellen mit dem RosetteSep-Kit gereinigt, um >90 % gereinigte Zellpopulationen zu erhalten.

Gereinigte Monozyten und gereinigte NK konnten unter Verwendung von RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS getrennt oder zusammen in Kultur gehalten und mit M-CSF bzw. IL-2 ergänzt, mit verschiedenen Stimuli (siehe oben) stimuliert und dann auf intrazelluläre Zytokine überprüft werden /Chemokine von Interesse (siehe oben). Gleichzeitig konnten die Überstände (konditioniertes Medium, CM) am Ende der In-vitro-Inkubationskultur geerntet und mittels ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).

Die 4-5-tägige In-vitro-Kultur von Monozyten wird 24 Stunden lang mit LPS plus IFNg (M1-Stimulus) oder (IL-4) (M2-Stimulus) weiter stimuliert, um die Makrophagenpolarisation zu untersuchen, indem Oberflächen-M1-Marker (TNF, CXCL10) oder M2-Marker untersucht werden (IL-10, CCL18), um die Prävalenz der Makrophagen-Polarisation in verschiedenen Gruppen von Covid-19-Patienten zu überprüfen.

Die epidemiologische Analyse wird unter Einbeziehung der Impfhistorie und der täglich nach der Krankenhausaufnahme erhobenen Daten durchgeführt. Die Archive von ATS Insubria liefern fehlende Daten.

Unter Berücksichtigung des immunologischen Profils werden Patienten mit Covid-19 auf Routineuntersuchungen und Folgendes getestet:

  • Lymphozyten-Immunphänotypisierung;
  • Bestimmung der Aktivität der C3- und C4-Komplementfraktionen;
  • Immunglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE) Serumspiegel;
  • Serumproteinelektrophorese;
  • Angiotensin-Converting-Enzym (ACE)-Serumspiegel;
  • CMV (Citomegalovirus) serologischer Test;
  • IL-6-Serumspiegel.

Studientyp

Beobachtungs

Einschreibung (Voraussichtlich)

150

Kontakte und Standorte

Dieser Abschnitt enthält die Kontaktdaten derjenigen, die die Studie durchführen, und Informationen darüber, wo diese Studie durchgeführt wird.

Studienorte

  • Italien
      • Varese, Italien, 21100
        • Rekrutierung
        • ATS Insubria
        • Kontakt:
        • Hauptermittler:
          • Giuseppe Ietto, MD
        • Hauptermittler:
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • Unterermittler:
          • Domenico Iovino, MD
        • Unterermittler:
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • Hauptermittler:
          • Giulio Carcano, Professor
        • Unterermittler:
          • Andreina Baj, MD
        • Unterermittler:
          • Walter Ageno, Professor
        • Unterermittler:
          • Francesco Acquati, Professor
        • Unterermittler:
          • Angelo Genoni, Dr
        • Unterermittler:
          • Denisa Baci, PhD
        • Unterermittler:
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • Unterermittler:
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • Unterermittler:
          • Elisa Monti, MD
        • Unterermittler:
          • Andrea Vigezzi, MD
        • Unterermittler:
          • Caterina Franchi, MD
        • Unterermittler:
          • Valentina Iori, MD
        • Unterermittler:
          • Federica Masci, MD

Teilnahmekriterien

Forscher suchen nach Personen, die einer bestimmten Beschreibung entsprechen, die als Auswahlkriterien bezeichnet werden. Einige Beispiele für diese Kriterien sind der allgemeine Gesundheitszustand einer Person oder frühere Behandlungen.

Zulassungskriterien

Studienberechtigtes Alter

18 Jahre und älter (Erwachsene, Älterer Erwachsener)

Akzeptiert gesunde Freiwillige

Nein

Studienberechtigte Geschlechter

Alle

Probenahmeverfahren

Nicht-Wahrscheinlichkeitsprobe

Studienpopulation

Patienten wurden positiv auf SARS-CoV-2 getestet

Beschreibung

Einschlusskriterien:

  • Alter: ≥ 18
  • SARS-CoV-2 dokumentierte Infektion

Ausschlusskriterien:

  • Weigerung, die Vereinbarung zu unterzeichnen (Einverständniserklärung);
  • Unfähigkeit, die Vereinbarung zu unterzeichnen;
  • HIV-, HCV-, HBV-Infektion (positiv gegenüber HBsAg).

Studienplan

Dieser Abschnitt enthält Einzelheiten zum Studienplan, einschließlich des Studiendesigns und der Messung der Studieninhalte.

Wie ist die Studie aufgebaut?

Designdetails

  • Beobachtungsmodelle: Nur Fall
  • Zeitperspektiven: Interessent

Kohorten und Interventionen

Gruppe / Kohorte
Intervention / Behandlung
Positiv auf SARS-CoV-2 getestet
Patienten, die positiv auf SARS-CoV-2 getestet wurden, werden in der Notaufnahme des Lehrkrankenhauses „Ospedale Di Circolo – ASST Settelaghi“ in Varese rekrutiert.
Diagnosetest: Studie zu immunvermittelten Mechanismen bei Patienten, die positiv auf SARS-CoV-2 getestet wurden
Phänotypische und funktionelle Analyse von Monozyten und NK-Zellen

Was misst die Studie?

Primäre Ergebnismessungen

Ergebnis Maßnahme
Maßnahmenbeschreibung
Zeitfenster
Aktivität der Immunzellen
Zeitfenster: 6 Monate
Die Hypothese der Wissenschaftler ist, dass Monozyten, NK-, CD4- UND CD8-T-Zellen, bei Patienten mit schwerer Infektion mit SARS-CoV-2 eine Beeinträchtigung ihrer Funktion zeigen: Zellen zeigen eine überwältigende Hyperaktivität, die eine pathologische Entzündungsreaktion mit einer massiven Produktion von hervorruft proinflammatorisches Zytokin, Ödeme und Lungenfibrose.
6 Monate

Sekundäre Ergebnismessungen

Ergebnis Maßnahme
Maßnahmenbeschreibung
Zeitfenster
Schutzfaktoren und neue therapeutische Strategien
Zeitfenster: 6 Monate
Die sekundären Ziele sind die Korrelation klinischer Daten und der Impfanamnese mit Labor-Immunmustern, um Schutzfaktoren für Covid 19 zu identifizieren und Wege für neue therapeutische Strategien zu eröffnen.
6 Monate

Mitarbeiter und Ermittler

Hier finden Sie Personen und Organisationen, die an dieser Studie beteiligt sind.

Sponsor

Università degli Studi dell'Insubria

Ermittler

  • Studienstuhl: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
  • Hauptermittler: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
  • Hauptermittler: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria

Publikationen und hilfreiche Links

Die Bereitstellung dieser Publikationen erfolgt freiwillig durch die für die Eingabe von Informationen über die Studie verantwortliche Person. Diese können sich auf alles beziehen, was mit dem Studium zu tun hat.

Allgemeine Veröffentlichungen

Studienaufzeichnungsdaten

Diese Daten verfolgen den Fortschritt der Übermittlung von Studienaufzeichnungen und zusammenfassenden Ergebnissen an ClinicalTrials.gov. Studienaufzeichnungen und gemeldete Ergebnisse werden von der National Library of Medicine (NLM) überprüft, um sicherzustellen, dass sie bestimmten Qualitätskontrollstandards entsprechen, bevor sie auf der öffentlichen Website veröffentlicht werden.

Haupttermine studieren

Studienbeginn (Tatsächlich)

27. April 2020

Primärer Abschluss (Voraussichtlich)

30. Juni 2020

Studienabschluss (Voraussichtlich)

31. Oktober 2020

Studienanmeldedaten

Zuerst eingereicht

3. Mai 2020

Zuerst eingereicht, das die QC-Kriterien erfüllt hat

3. Mai 2020

Zuerst gepostet (Tatsächlich)

5. Mai 2020

Studienaufzeichnungsaktualisierungen

Letztes Update gepostet (Tatsächlich)

5. Mai 2020

Letztes eingereichtes Update, das die QC-Kriterien erfüllt

3. Mai 2020

Zuletzt verifiziert

1. Mai 2020

Mehr Informationen

Begriffe im Zusammenhang mit dieser Studie

Zusätzliche relevante MeSH-Bedingungen

Andere Studien-ID-Nummern

  • 67/2020

Plan für individuelle Teilnehmerdaten (IPD)

Planen Sie, individuelle Teilnehmerdaten (IPD) zu teilen?

Unentschieden

Arzneimittel- und Geräteinformationen, Studienunterlagen

Studiert ein von der US-amerikanischen FDA reguliertes Arzneimittelprodukt

Nein

Studiert ein von der US-amerikanischen FDA reguliertes Geräteprodukt

Nein

Diese Informationen wurden ohne Änderungen direkt von der Website clinicaltrials.gov abgerufen. Wenn Sie Ihre Studiendaten ändern, entfernen oder aktualisieren möchten, wenden Sie sich bitte an register@clinicaltrials.gov. Sobald eine Änderung auf clinicaltrials.gov implementiert wird, wird diese automatisch auch auf unserer Website aktualisiert .

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