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Attività dei monociti e delle cellule NK nei pazienti Covid-19

3 maggio 2020 aggiornato da: Ietto Giuseppe, Università degli Studi dell'Insubria

Studio dei meccanismi immuno-mediati in pazienti risultati positivi per SARS-CoV-2: analisi fenotipica e funzionale di monociti e cellule NK nel sangue di soggetti affetti da Covid 19

SARS-CoV-2 appartiene alla famiglia dei beta-coronavirus e la sua via di trasmissione e i suoi sintomi seguono quelli di tutti i coronavirus acquisiti in comunità. La principale differenza del nuovo Coronavirus è il tasso di mortalità più elevato, che si aggira intorno al 3%.

Il tasso di mortalità è superiore all'1% solo per i pazienti con più di 50 anni, mentre fino a 40 anni è inferiore allo 0,4%. Ad oggi non sono stati dichiarati decessi tra i bambini sotto i 10 anni. Il tasso di mortalità è quasi doppio per i maschi piuttosto che per le femmine. Questa distribuzione del tasso di mortalità in base all'età dei pazienti infetti potrebbe essere solo parzialmente attribuita ad altre comorbidità oltre alla grande età. Infatti, i pazienti senza condizioni preesistenti hanno comunque un tasso di mortalità dello 0,9%.

Il tasso quasi nullo di malattie gravi nei bambini e in generale nei pazienti di età inferiore ai 40 anni è del tutto inspiegabile. Neonati, bambini e giovani possono essere infettati, ma l'infezione si autolimita rapidamente o è asintomatica. I pazienti più anziani subiscono gravi danni polmonari come conseguenza di una risposta immunitaria che tarda ad arrivare.

La possibile spiegazione di questi fenomeni potrebbe essere qualcosa che assicuri la capacità di sollecitare la risposta a SARS-CoV-2 nei giovani indipendentemente dalla novità del virus stesso.

Sembrerebbe che i giovani siano già sensibilizzati agli antigeni del virus senza un precedente contatto.

Questa immunità non è propriamente specifica, ma "parzialmente specifica" per molti antigeni del virus, comunque in grado di limitare l'infezione nell'organismo. Qualcosa ha stimolato il sistema immunitario e ha disperso l'immunità contro sempre più antigeni presenti. I bambini sono la fascia di età maggiormente esposta a tutti i virus circolanti nella comunità.

Questa immunità non è persistente ma svanisce progressivamente. Protegge dall'età di due anni, quando si verifica l'ipotetica stimolazione, alla quinta decade a causa della sua lenta diminuzione.

L'unico stimolo esterno che ricevono le persone sane sono i vaccini. Tutte le vaccinazioni e in particolare tetanica, tossoidi difterici e batteri inattivati ​​come la pertosse potrebbero stimolare il sistema immunitario. Sviluppano l'immunità specifica ma generano anche un'immunità germogliante contro gli antigeni in transito, come i coronavirus e altri virus circolanti nella comunità.

L'immunità sviluppata offre una certa protezione contro le infezioni virali multiple per anni fino a quando il naturale svanisce.

Dopo la quinta decade, quell'immunità è più lenta da richiamare e riattivare. Inoltre, i trapiantati e i pazienti con infezione da HIV, che hanno un sistema immunitario inibito, inaspettatamente, non sembrano soffrire delle peggiori complicanze dell'infezione da SARS-CoV-2. Uno squilibrio del sistema immunitario potrebbe svolgere un ruolo fondamentale durante la reazione al virus, limitando le conseguenze distruttive di un'eccessiva infiammazione.

Secondo l'ipotesi medica su cui si basa il protocollo, i giovani potrebbero beneficiare di un adattamento funzionale delle cellule immunitarie innate indotto attraverso la riprogrammazione epigenetica e, soprattutto, di una preesistente immunità "parzialmente specifica" ai virus di comunità causata da "bystander effetto" di precedenti vaccinazioni. In questo studio, esploreremo le principali differenze esistenti tra i pazienti infetti da SARS-CoV-2 che sperimentano la malattia a diverso grado di gravità. Supponiamo di riconoscere diverse popolazioni di pazienti, ognuna con uno specifico pattern immunologico. Potrebbe differire in termini di citochine, livelli sierici di fattori solubili e attività delle cellule immunitarie sia del compartimento innato che di quello acquisito. Le prove di un ruolo di questi fenomeni immunologici nella patogenesi del Covid-19 sono le basi per l'attuazione di trattamenti terapeutici immunomodulatori. Inoltre, la definizione di un profilo di rischio immunologico potrebbe adattare le terapie consolidate a ciascun tipo di paziente.

Panoramica dello studio

Stato

Sconosciuto

Condizioni

Intervento / Trattamento

Descrizione dettagliata

Secondo l'ipotesi medica su cui si basa il protocollo, i giovani potrebbero beneficiare di un adattamento funzionale delle cellule immunitarie innate indotto attraverso la riprogrammazione epigenetica e, soprattutto, di una preesistente immunità "parzialmente specifica" ai virus di comunità causata da "bystander effetto" di precedenti vaccinazioni. In questo studio, esploreremo le principali differenze esistenti tra i pazienti infetti da SARS-CoV-2 che sperimentano la malattia a diverso grado di gravità. Supponiamo di riconoscere diverse popolazioni di pazienti, ognuna con uno specifico pattern immunologico. Potrebbe differire in termini di citochine, livelli sierici di fattori solubili e attività delle cellule immunitarie sia del compartimento innato che di quello acquisito.

I dati saranno raccolti utilizzando 3 approcci:

  • Un'analisi sperimentale, per cluster di pazienti, per studiare la risposta immunitaria innata e per identificare i profili genetici.
  • Un'analisi epidemiologica, al fine di identificare la storia vaccinale dei pazienti;
  • Un'analisi clinica, per rilevare il profilo immunologico;

Per l'analisi specifica, per studiare la risposta immunitaria innata e per identificare i profili genetici, gli scienziati analizzeranno, dal sangue periferico, cellule NK, monociti, cellule T CD4 e CD8 di entrambi i gruppi: pazienti sani (testati negativi per SARS-CoV -2) e malati dei sottogruppi (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

Da diversi gruppi di pazienti, campioni di sangue (10-15 mL) saranno prelevati in provette EDTA, centrifugate a 360 g per 10 minuti per ottenere plasma che sarà conservato a -80°C per la successiva analisi per citochine e chemochine di interesse mediante ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 e CXCL10) al termine dell'arruolamento.

I pellet cellulari saranno riportati al volume iniziale con PBS e diluiti 1:1 (v/v), quindi sottoposti a stratificazione in gradiente di densità con Ficoll Histopaque-1077, a 500 g per 30 minuti. Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) derivate dall'anello bianco saranno raccolte, lavate due volte in PBS, e quindi utilizzate per successivi esperimenti utilizzando un saggio di citometria a flusso (REFF). La coltura in vitro utilizzando PBMC può variare da ex vivo 1 giorno a pochi giorni e le cellule saranno mantenute in terreno RPMI 1640, integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM di l-glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (P/S), a 37°C, 5% CO2.

Per eseguire l'analisi fenotipica ex vivo del selezionatore di cellule attivate dalla fluorescenza (FACS), 2,5x105 di PBMC totali freschi per provetta FACS saranno colorati per 30 minuti a 4°C con anticorpi monoclonali (mAbs) come segue: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Dopo l'impostazione Forward/Side Scatter, le cellule NK saranno identificate in due sottoinsiemi cellulari, cioè come cellule CD3- e CD56dim CD16+ (cellule NK CD56dim, il sottoinsieme principale, circa il 90%) e cellule CD3- e CD56bright CD16-/low ( Cellule NK luminose CD56, il sottoinsieme minore, circa il 10%). L'espressione di altri marcatori sarà valutata su entrambi i subset di cellule gated.

Per la valutazione FACS ex vivo dell'analisi del fenotipo dei monociti, 2.5x105 di PBMC totali freschi per provetta FACS saranno colorati per 30 minuti a 4°C con mAb come segue: CD45-APC, CD14-FITC e CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Dopo l'impostazione Forward/Side Scatter, i monociti saranno identificati in tre sottoinsiemi, ovvero come cellule CD14+ e CD16- (il sottoinsieme principale, circa il 90%), CD14+ CD16+ (il sottoinsieme minore, circa il 10%) e CD14-/basso CD16+ (l'altro sottoinsieme minore).

Valuteremo anche il fenotipo per le cellule T CD4 e CD8 e il rapporto CD4/CD8 T utilizzando 2x105 di PBMC totali fresche, come precedentemente descritto, con i seguenti mAb: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 e T regolatori (Treg ) cellule, come CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

Le PBMC saranno anche stimolate in vitro per 4 ore con diversi tipi di stimoli, come LPS (riconosciuto dal TLR4), poli(I:C) (riconosciuto dal TLR3), poli(I:C) più IL-2 più IL-12 e forbolo miristato acetato (PMA) più ionomicina in presenza di monensina e brefeldina. Questa procedura consentirà di studiare la produzione specifica di citochine/chemochine da cellule NK e monociti utilizzando un saggio intracellulare FACS, come descritto in precedenza (REFF). Per le cellule NK, misureremo IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE e CD107a-PE (marker di degranulazione). Per i monociti studieremo: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (marcatori pro-infiammatori di tipo M1) e TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 marcatori anti-infiammatori di tipo) Qualora la quantità di PBMCs sia sufficiente, verranno allestiti altri test funzionali in vitro su cellule NK e monociti. In particolare, le PBMC saranno studiate per la degranulazione/funzione citotossica delle cellule NK in 4 h verso la linea cellulare eritroleucemica K562 valutando la superficie CD107a-PE mediante un saggio citofluorimetrico a flusso (REFF).

Ogni volta che la quantità di PBMC sarà sufficiente, i monociti saranno purificati utilizzando microsfere anti-CD14 con separatore magnetico e cellule NK con kit RosetteSep per ottenere popolazioni cellulari purificate >90%.

Monociti purificati e NK purificati possono essere mantenuti separati o insieme in coltura utilizzando il terreno RPMI 1640 con 10% FBS e integrati rispettivamente con M-CSF e IL-2, stimolati con stimoli diversi (vedi sopra) e quindi controllati per le citochine intracellulari /chemochine di interesse (vedi sopra). Allo stesso tempo, i supernatanti (terreno condizionato, CM) potrebbero essere raccolti alla fine della coltura di incubazione in vitro e valutati per citochine/chemochine utilizzando ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).

La coltura in vitro di monociti di 4-5 giorni sarà ulteriormente stimolata 24 ore con LPS più IFNg (stimolo M1) o (IL-4) (stimolo M2) per studiare la polarizzazione dei macrofagi studiando marcatori di superficie M1 (TNF, CXCL10) o marcatori M2 (IL-10, CCL18) per verificare la prevalenza della polarizzazione dei macrofagi in diversi gruppi di pazienti Covid-19.

L'analisi epidemiologica verrà effettuata integrando sia la storia vaccinale che i dati raccolti giornalmente dopo il ricovero ospedaliero. L'archivio ATS Insubria fornirà i dati mancanti.

Considerando il profilo immunologico, i pazienti con Covid-19 saranno testati per esami di routine e quanto segue:

  • immunofenotipizzazione dei linfociti;
  • determinazione dell'attività delle frazioni del complemento C3 e C4;
  • livello sierico di immunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE);
  • elettroforesi delle proteine ​​sieriche;
  • livello sierico dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE);
  • Test sierologico CMV (Citomegalovirus);
  • Livello sierico di IL-6.

Tipo di studio

Osservativo

Iscrizione (Anticipato)

150

Contatti e Sedi

Questa sezione fornisce i recapiti di coloro che conducono lo studio e informazioni su dove viene condotto lo studio.

Luoghi di studio

  • Italia
      • Varese, Italia, 21100
        • Reclutamento
        • ATS Insubria
        • Contatto:
        • Investigatore principale:
          • Giuseppe Ietto, MD
        • Investigatore principale:
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • Sub-investigatore:
          • Domenico Iovino, MD
        • Sub-investigatore:
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • Investigatore principale:
          • Giulio Carcano, Professor
        • Sub-investigatore:
          • Andreina Baj, MD
        • Sub-investigatore:
          • Walter Ageno, Professor
        • Sub-investigatore:
          • Francesco Acquati, Professor
        • Sub-investigatore:
          • Angelo Genoni, Dr
        • Sub-investigatore:
          • Denisa Baci, PhD
        • Sub-investigatore:
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • Sub-investigatore:
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • Sub-investigatore:
          • Elisa Monti, MD
        • Sub-investigatore:
          • Andrea Vigezzi, MD
        • Sub-investigatore:
          • Caterina Franchi, MD
        • Sub-investigatore:
          • Valentina Iori, MD
        • Sub-investigatore:
          • Federica Masci, MD

Criteri di partecipazione

I ricercatori cercano persone che corrispondano a una certa descrizione, chiamata criteri di ammissibilità. Alcuni esempi di questi criteri sono le condizioni generali di salute di una persona o trattamenti precedenti.

Criteri di ammissibilità

Età idonea allo studio

18 anni e precedenti (Adulto, Adulto più anziano)

Accetta volontari sani

No

Sessi ammissibili allo studio

Tutto

Metodo di campionamento

Campione non probabilistico

Popolazione di studio

I pazienti sono risultati positivi al SARS-CoV-2

Descrizione

Criterio di inclusione:

  • Età: ≥ 18 anni
  • Infezione documentata da SARS-CoV-2

Criteri di esclusione:

  • Rifiuto alla sottoscrizione del contratto (consenso informato);
  • Impossibilità di firmare l'accordo;
  • Infezione da HIV, HCV, HBV (positivo per HBsAg).

Piano di studio

Questa sezione fornisce i dettagli del piano di studio, compreso il modo in cui lo studio è progettato e ciò che lo studio sta misurando.

Come è strutturato lo studio?

Dettagli di progettazione

  • Modelli osservazionali: Solo caso
  • Prospettive temporali: Prospettiva

Coorti e interventi

Gruppo / Coorte
Intervento / Trattamento
Testato positivo per SARS-CoV-2
I pazienti, risultati positivi al SARS-CoV-2, saranno reclutati nel Pronto Soccorso dell'Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi di Varese.
Test diagnostico: Studio dei meccanismi immuno-mediati in pazienti risultati positivi al SARS-CoV-2
Analisi fenotipica e funzionale di monociti e cellule NK

Cosa sta misurando lo studio?

Misure di risultato primarie

Misura del risultato
Misura Descrizione
Lasso di tempo
Attività delle cellule immunitarie
Lasso di tempo: 6 mesi
L'ipotesi degli scienziati è che i monociti, le cellule T NK, CD4 E CD8, nei pazienti con grave infezione da SARS-CoV-2, mostrino una compromissione della loro funzione: le cellule rivelano un'iperattività prepotente che provoca una risposta infiammatoria patologica con una massiccia produzione di citochine proinfiammatorie, edema e fibrosi polmonare.
6 mesi

Misure di risultato secondarie

Misura del risultato
Misura Descrizione
Lasso di tempo
Fattori protettivi e nuove strategie terapeutiche
Lasso di tempo: 6 mesi
Gli obiettivi secondari sono correlare i dati clinici e la storia vaccinale con il modello immunitario di laboratorio per identificare i fattori protettivi per Covid 19 e aprire percorsi per nuove strategie terapeutiche.
6 mesi

Collaboratori e investigatori

Qui è dove troverai le persone e le organizzazioni coinvolte in questo studio.

Sponsor

Università degli Studi dell'Insubria

Investigatori

  • Cattedra di studio: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
  • Investigatore principale: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
  • Investigatore principale: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria

Pubblicazioni e link utili

La persona responsabile dell'inserimento delle informazioni sullo studio fornisce volontariamente queste pubblicazioni. Questi possono riguardare qualsiasi cosa relativa allo studio.

Pubblicazioni generali

Studiare le date dei record

Queste date tengono traccia dell'avanzamento della registrazione dello studio e dell'invio dei risultati di sintesi a ClinicalTrials.gov. I record degli studi e i risultati riportati vengono esaminati dalla National Library of Medicine (NLM) per assicurarsi che soddisfino specifici standard di controllo della qualità prima di essere pubblicati sul sito Web pubblico.

Studia le date principali

Inizio studio (Effettivo)

27 aprile 2020

Completamento primario (Anticipato)

30 giugno 2020

Completamento dello studio (Anticipato)

31 ottobre 2020

Date di iscrizione allo studio

Primo inviato

3 maggio 2020

Primo inviato che soddisfa i criteri di controllo qualità

3 maggio 2020

Primo Inserito (Effettivo)

5 maggio 2020

Aggiornamenti dei record di studio

Ultimo aggiornamento pubblicato (Effettivo)

5 maggio 2020

Ultimo aggiornamento inviato che soddisfa i criteri QC

3 maggio 2020

Ultimo verificato

1 maggio 2020

Maggiori informazioni

Termini relativi a questo studio

Termini MeSH pertinenti aggiuntivi

Altri numeri di identificazione dello studio

  • 67/2020

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No

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