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Covid-19 환자의 단핵구 및 NK 세포 활동

2020년 5월 3일 업데이트: Ietto Giuseppe, Università degli Studi dell'Insubria

SARS-CoV-2 양성 판정을 받은 환자의 면역 매개 메커니즘 연구: Covid 19에 영향을 받은 피험자의 혈액 내 단핵구 및 NK 세포의 표현형 및 기능 분석

SARS-CoV-2는 베타 코로나바이러스과에 속하며 전파 경로와 증상은 모든 지역사회 획득 코로나바이러스의 전파 경로와 증상을 따릅니다. 신종 코로나바이러스의 주요 차이점은 치사율이 약 3%로 높다는 것입니다.

사망률은 50세 이상 환자의 경우에만 1% 이상인 반면 40세까지는 0.4% 미만입니다. 현재까지 10세 미만의 어린이 중 사망자는 보고되지 않았습니다. 사망률은 여성보다 남성이 거의 두 배입니다. 감염된 환자의 연령에 따른 사망률 분포는 고령 외에 다른 동반 질환에 부분적으로만 기인할 수 있습니다. 사실 기존 질환이 없는 환자의 치명률은 0.9%입니다.

어린이 및 일반적으로 40세 미만의 환자에서 중증 질환의 거의 영률이 없다는 것은 상당히 설명할 수 없습니다. 유아, 어린이 및 청소년은 감염될 수 있지만 감염은 빠르게 자가 제한되거나 증상이 없습니다. 고령 환자는 면역 반응이 늦게 나타나 심각한 폐 손상을 입습니다.

이러한 현상에 대한 가능한 설명은 바이러스 자체의 새로움과는 독립적으로 젊은 사람들이 SARS-CoV-2에 신속하게 대응할 수 있는 능력을 보장하는 것일 수 있습니다.

젊은 사람들은 사전 접촉 없이 이미 바이러스의 항원에 민감해진 것 같습니다.

이 면역은 실제로 특이적이지는 않지만 바이러스의 많은 항원에 대해 "부분적으로 특이적"이지만 유기체의 감염을 제한할 수 있습니다. 무언가가 면역 체계를 자극하여 점점 더 많은 항원에 대한 면역을 분산시켰습니다. 어린이는 지역사회에서 유행하는 모든 바이러스에 가장 많이 노출되는 연령대입니다.

이 면역은 지속적이지는 않지만 점진적으로 사라집니다. 그것은 가상의 자극이 발생하는 2세부터 천천히 감소하기 때문에 50대까지 보호합니다.

건강한 사람들이 받는 유일한 외부 자극은 백신입니다. 모든 백신, 특히 파상풍, 디프테리아 톡소이드 및 백일해와 같은 불활성화 박테리아는 면역 체계를 자극할 수 있습니다. 그들은 특정 면역을 개발하지만 코로나 바이러스 및 기타 지역 사회 순환 바이러스와 같이 이동 중인 항원에 대한 싹트기 면역도 생성합니다.

개발된 면역은 자연적으로 사라질 때까지 수년 동안 여러 바이러스 감염에 대한 보호를 제공합니다.

50년 이후에는 그 면역이 회상되고 재활성화되는 속도가 느려집니다. 또한 면역 체계가 억제된 이식 수혜자와 HIV 감염 환자는 예기치 않게 SARS-CoV-2 감염의 최악의 합병증을 겪지 않는 것 같습니다. 면역계 불균형은 바이러스에 대한 반응 동안 중추적인 역할을 하여 과도한 염증의 파괴적인 결과를 제한할 수 있습니다.

프로토콜의 기반이 되는 의학적 가설에 따르면, 젊은이들은 후생유전학적 재프로그래밍을 통해 유도된 선천 면역 세포의 기능적 적응, 특히 "방관자" 이전 예방 접종의 효과". 이 연구에서 우리는 SARS-CoV-2에 감염된 환자들 사이에 존재하는 주요 차이점을 탐구할 것입니다. 우리는 특정한 면역학적 패턴을 가진 각기 다른 환자 집단을 인식한다고 가정합니다. 선천성 구획과 후천 구획의 사이토카인, 수용성 인자 혈청 수준 및 면역 세포 활성 측면에서 다를 수 있습니다. Covid-19의 발병기전에서 이러한 면역학적 현상의 역할에 대한 증거는 치료적 면역 조절 치료를 시행하기 위한 기반입니다. 또한, 면역학적 위험 프로파일의 정의는 확립된 치료법을 각 종류의 환자에게 맞출 수 있습니다.

연구 개요

상태

알려지지 않은

정황

개입 / 치료

상세 설명

프로토콜의 기반이 되는 의학적 가설에 따르면, 젊은이들은 후생유전학적 재프로그래밍을 통해 유도된 선천 면역 세포의 기능적 적응, 특히 "방관자" 이전 예방 접종의 효과". 이 연구에서 우리는 SARS-CoV-2에 감염된 환자들 사이에 존재하는 주요 차이점을 탐구할 것입니다. 우리는 특정한 면역학적 패턴을 가진 각기 다른 환자 집단을 인식한다고 가정합니다. 선천성 구획과 후천 구획의 사이토카인, 수용성 인자 혈청 수준 및 면역 세포 활성 측면에서 다를 수 있습니다.

데이터는 3가지 접근 방식을 사용하여 수집됩니다.

  • 선천적 면역 반응을 연구하고 유전적 프로필을 확인하기 위한 환자 집단에 대한 실험적 분석.
  • 환자의 예방접종 이력을 확인하기 위한 역학 분석
  • 면역학적 프로파일을 검출하기 위한 임상 분석;

특정 분석을 위해 선천적 면역 반응을 연구하고 유전적 프로필을 확인하기 위해 과학자들은 말초 혈액에서 NK 세포, 단핵구, CD4 및 CD8 T 세포 두 그룹을 분석합니다. 건강한 환자(SARS-CoV에 대해 음성으로 테스트됨) -2) 및 하위 그룹의 아픈 환자(AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

서로 다른 환자 그룹의 혈액 샘플(10-15mL)을 EDTA 튜브에 채취하고 360g에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 얻은 다음 관심 사이토카인 및 케모카인에 대한 후속 분석을 위해 -80°C에 보관합니다. 등록 종료 시 ELISA(IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 및 CXCL10)에 의해.

세포 펠렛을 PBS로 초기 부피로 되돌리고 1:1(v/v)로 희석한 다음 Ficoll Histopaque-1077로 500g에서 30분 동안 밀도 구배 계층화를 수행합니다. 백색 고리에서 유래된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수집하고, PBS로 2회 세척한 후 유동 세포 분석법(REFF)을 사용한 후속 실험에 사용합니다. PBMC를 사용한 체외 배양은 생체 외 1일에서 며칠까지 다양할 수 있으며, 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM l-글루타민, 100U/mL 페니실린이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지됩니다. 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(P/S), 37°C, 5% CO2.

생체외 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 표현형 분석을 수행하기 위해 FACS 튜브당 2.5x105개의 신선한 총 PBMC를 다음과 같이 단일 클론 항체(mAbs)로 4°C에서 30분 동안 염색합니다: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Forward/Side Scatter 설정에 따라 NK 세포는 CD3- 및 CD56dim CD16+ 세포(CD56dim NK 세포, 주요 하위 집합, 약 90%)와 CD3- 및 CD56bright CD16-/low 세포( CD56밝은 NK 세포, 마이너 서브세트, 약 10%). 다른 마커 발현은 게이트된 셀의 두 하위 집합 모두에서 평가됩니다.

단핵구 표현형 분석의 생체외 FACS 평가를 위해, FACS 튜브당 신선한 전체 PBMC의 2.5x105개는 다음과 같은 mAb로 4°C에서 30분 동안 염색됩니다: CD45-APC, CD14-FITC 및 CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Forward/Side Scatter 설정에 따라 단핵구는 CD14+ 및 CD16- 세포(주요 하위 집합, 약 90%), CD14+ CD16+(부 하위 집합, 약 10%), CD14-/low CD16+ 등 세 가지 하위 집합으로 식별됩니다. (다른 마이너 하위 집합).

또한 CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 및 T 조절(Treg ) 세포, CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

PBMC는 또한 LPS(TLR4에 의해 인식됨), 폴리(I:C)(TLR3에 의해 인식됨), 폴리(I:C) 플러스 IL-2 플러스와 같은 다양한 유형의 자극으로 4시간 동안 시험관 내 자극됩니다. 모넨신 및 브레펠딘 존재 하에 IL-12 및 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) + 이오노마이신. 이 절차는 이전에 설명한 대로 FACS 세포내 분석을 사용하여 NK 세포 및 단핵구에서 특정 사이토카인/케모카인 생산을 연구할 수 있게 합니다(REFF). NK 세포의 경우 IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE 및 CD107a-PE(탈과립 마커)를 측정합니다. 단핵구의 경우 다음을 조사할 것입니다. -유형 항염증 마커) PBMC의 양이 충분할 때마다 NK 세포 및 단핵구에 대한 다른 기능적 체외 시험이 설정됩니다. 특히, PBMC는 유세포형광분석법(REFF)을 사용하여 표면 CD107a-PE를 평가하는 에리트로류스혈증 K562 세포주에 대한 4시간 NK 세포 탈과립/세포독성 기능에 대해 연구될 것이다.

PBMC의 양이 충분할 때마다 자기 분리기가 있는 항-CD14 마이크로비드와 RosetteSep 키트가 있는 NK 세포를 사용하여 단핵구를 정제하여 >90% 정제된 세포 집단을 얻습니다.

정제된 단핵구 및 정제된 NK는 각각 M-CSF 및 IL-2로 보충되고 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양에서 분리되거나 함께 유지될 수 있으며, 다른 자극(위 참조)으로 자극된 다음 세포내 사이토카인을 확인합니다. /관심 케모카인(위 참조). 동시에, 상청액(조절 배지, CM)은 시험관내 인큐베이션 배양의 끝에서 수확될 수 있었고 ELISA(IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL-10, 12, CXCL10).

단핵구의 4-5일 체외 배양은 LPS 플러스 IFNg(M1 자극) 또는 (IL-4)(M2 자극)로 24시간 더 자극되어 표면 M1 마커(TNF, CXCL10) 또는 M2 마커를 연구하는 대식세포 분극화를 조사합니다. (IL-10, CCL18) 다른 Covid-19 환자 그룹에서 대 식세포 분극화의 유병률을 확인합니다.

역학 분석은 예방 접종 이력과 입원 후 매일 수집되는 데이터를 통합하여 수행됩니다. ATS Insubria 아카이브는 누락된 데이터를 제공합니다.

면역학적 프로필을 고려하여 Covid-19 환자는 정기 검사 및 다음 검사를 받게 됩니다.

  • 림프구 면역 표현형;
  • C3 및 C4 보체 분획 활성의 결정;
  • 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgE) 혈청 수준;
  • 혈청 단백질 전기영동;
  • 안지오텐신 전환 효소(ACE) 혈청 수준;
  • CMV(Citomegalovirus) 혈청 검사;
  • IL-6 혈청 수준.

연구 유형

관찰

등록 (예상)

150

연락처 및 위치

이 섹션에서는 연구를 수행하는 사람들의 연락처 정보와 이 연구가 수행되는 장소에 대한 정보를 제공합니다.

연구 장소

  • 이탈리아
      • Varese, 이탈리아, 21100
        • 모병
        • ATS Insubria
        • 연락하다:
        • 수석 연구원:
          • Giuseppe Ietto, MD
        • 수석 연구원:
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • 부수사관:
          • Domenico Iovino, MD
        • 부수사관:
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • 수석 연구원:
          • Giulio Carcano, Professor
        • 부수사관:
          • Andreina Baj, MD
        • 부수사관:
          • Walter Ageno, Professor
        • 부수사관:
          • Francesco Acquati, Professor
        • 부수사관:
          • Angelo Genoni, Dr
        • 부수사관:
          • Denisa Baci, PhD
        • 부수사관:
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • 부수사관:
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • 부수사관:
          • Elisa Monti, MD
        • 부수사관:
          • Andrea Vigezzi, MD
        • 부수사관:
          • Caterina Franchi, MD
        • 부수사관:
          • Valentina Iori, MD
        • 부수사관:
          • Federica Masci, MD

참여기준

연구원은 적격성 기준이라는 특정 설명에 맞는 사람을 찾습니다. 이러한 기준의 몇 가지 예는 개인의 일반적인 건강 상태 또는 이전 치료입니다.

자격 기준

공부할 수 있는 나이

18년 이상 (성인, 고령자)

건강한 자원 봉사자를 받아들입니다

아니

연구 대상 성별

모두

샘플링 방법

비확률 샘플

연구 인구

SARS-CoV-2 양성 반응을 보인 환자

설명

포함 기준:

  • 연령: ≥ 18
  • SARS-CoV-2 문서화된 감염

제외 기준:

  • 계약 서명 거부(정보에 입각한 동의)
  • 계약에 서명할 수 없음
  • HIV, HCV, HBV(HBsAg 양성) 감염.

공부 계획

이 섹션에서는 연구 설계 방법과 연구가 측정하는 내용을 포함하여 연구 계획에 대한 세부 정보를 제공합니다.

연구는 어떻게 설계됩니까?

디자인 세부사항

  • 관찰 모델: 케이스 전용
  • 시간 관점: 유망한

코호트 및 개입

그룹/코호트
개입 / 치료
SARS-CoV-2 양성 판정
SARS-CoV-2 양성 판정을 받은 환자는 바레세에 있는 "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" 교육 병원의 E.R.에 모집됩니다.
진단 검사: SARS-CoV-2 양성 반응을 보인 환자의 면역 매개 메커니즘 연구
단핵구 및 NK 세포의 표현형 및 기능 분석

연구는 무엇을 측정합니까?

주요 결과 측정

결과 측정
측정값 설명
기간
면역 세포 활동
기간: 6 개월
과학자들의 가설은 SARS-CoV-2에 심각한 감염이 있는 환자의 단핵구, NK, CD4 및 CD8 T 세포가 기능 장애를 보인다는 것입니다. 전 염증성 사이토 카인, 부종 및 폐 섬유증.
6 개월

2차 결과 측정

결과 측정
측정값 설명
기간
보호 요인 및 새로운 치료 전략
기간: 6 개월
2차 목표는 임상 데이터 및 백신 접종 이력을 실험실 면역 패턴과 연관시켜 Covid 19에 대한 보호 요인을 식별하고 새로운 치료 전략을 위한 경로를 여는 것입니다.
6 개월

공동 작업자 및 조사자

여기에서 이 연구와 관련된 사람과 조직을 찾을 수 있습니다.

스폰서

Università degli Studi dell'Insubria

수사관

  • 연구 의자: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
  • 수석 연구원: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
  • 수석 연구원: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria

간행물 및 유용한 링크

연구에 대한 정보 입력을 담당하는 사람이 자발적으로 이러한 간행물을 제공합니다. 이것은 연구와 관련된 모든 것에 관한 것일 수 있습니다.

일반 간행물

연구 기록 날짜

이 날짜는 ClinicalTrials.gov에 대한 연구 기록 및 요약 결과 제출의 진행 상황을 추적합니다. 연구 기록 및 보고된 결과는 공개 웹사이트에 게시되기 전에 특정 품질 관리 기준을 충족하는지 확인하기 위해 국립 의학 도서관(NLM)에서 검토합니다.

연구 주요 날짜

연구 시작 (실제)

2020년 4월 27일

기본 완료 (예상)

2020년 6월 30일

연구 완료 (예상)

2020년 10월 31일

연구 등록 날짜

최초 제출

2020년 5월 3일

QC 기준을 충족하는 최초 제출

2020년 5월 3일

처음 게시됨 (실제)

2020년 5월 5일

연구 기록 업데이트

마지막 업데이트 게시됨 (실제)

2020년 5월 5일

QC 기준을 충족하는 마지막 업데이트 제출

2020년 5월 3일

마지막으로 확인됨

2020년 5월 1일

추가 정보

이 연구와 관련된 용어

추가 관련 MeSH 약관

기타 연구 ID 번호

  • 67/2020

개별 참가자 데이터(IPD) 계획

개별 참가자 데이터(IPD)를 공유할 계획입니까?

미정

약물 및 장치 정보, 연구 문서

미국 FDA 규제 의약품 연구

아니

미국 FDA 규제 기기 제품 연구

아니

이 정보는 변경 없이 clinicaltrials.gov 웹사이트에서 직접 가져온 것입니다. 귀하의 연구 세부 정보를 변경, 제거 또는 업데이트하도록 요청하는 경우 register@clinicaltrials.gov. 문의하십시오. 변경 사항이 clinicaltrials.gov에 구현되는 즉시 저희 웹사이트에도 자동으로 업데이트됩니다. .

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