Активность моноцитов и NK-клеток у пациентов с Covid-19
Изучение иммуноопосредованных механизмов у пациентов с положительным тестом на SARS-CoV-2: фенотипический и функциональный анализ моноцитов и NK-клеток в крови субъектов, пострадавших от Covid-19
SARS-CoV-2 принадлежит к семейству бета-коронавирусов, и его путь передачи и симптомы аналогичны всем внебольничным коронавирусам. Главное отличие нового коронавируса — более высокая смертность, около 3%.
Смертность составляет более 1% только у пациентов старше 50 лет, тогда как до 40 лет менее 0,4%. Летальных исходов среди детей до 10 лет на сегодняшний день не зарегистрировано. Смертность среди мужчин почти вдвое выше, чем среди женщин. Такое распределение смертности по возрасту инфицированных пациентов можно лишь частично объяснить другими сопутствующими заболеваниями, помимо преклонного возраста. Фактически, у пациентов без ранее существовавших заболеваний уровень летальности составляет 0,9%.
Почти нулевой уровень тяжелых заболеваний у детей и вообще у пациентов моложе 40 лет совершенно необъясним. Младенцы, дети и молодые люди могут быть инфицированы, но инфекция быстро проходит самостоятельно или протекает бессимптомно. Пожилые пациенты подвергаются серьезному повреждению легких в результате запоздалого иммунного ответа.
Возможным объяснением этих явлений может быть что-то, что обеспечивает возможность быстрой реакции на SARS-CoV-2 у молодых людей независимо от новизны самого вируса.
Казалось бы, молодые люди уже сенсибилизированы к антигенам вируса без предварительного контакта.
Этот иммунитет не совсем специфичен, а «частично специфичен» для многих антигенов вируса, однако способен ограничивать инфекцию в организме. Что-то стимулировало иммунную систему, и это рассеивало иммунитет против все большего количества присутствующих антигенов. Дети являются возрастной группой, наиболее подверженной воздействию всех вирусов, циркулирующих в обществе.
Этот иммунитет не стойкий, а постепенно исчезает. Он защищает от двухлетнего возраста, когда происходит гипотетическая стимуляция, до пятого десятилетия из-за его медленного снижения.
Единственной внешней стимуляцией, которую получают здоровые люди, являются вакцины. Все прививки и особенно столбнячный, дифтерийный анатоксины и инактивированные бактерии, такие как коклюш, могут стимулировать иммунную систему. Они вырабатывают специфический иммунитет, но также генерируют прорастающий иммунитет против транзиторных антигенов, таких как коронавирусы и другие вирусы, циркулирующие в сообществе.
Выработанный иммунитет дает некоторую защиту от множественной вирусной инфекции на годы, пока не угаснет естественный.
После пятого десятилетия этот иммунитет медленнее вспоминается и реактивируется. Кроме того, реципиенты трансплантатов и ВИЧ-инфицированные пациенты, у которых неожиданно подавлена иммунная система, по-видимому, не страдают от тяжелых осложнений инфекции SARS-CoV-2. Дисбаланс иммунной системы может играть ключевую роль во время реакции на вирус, ограничивая разрушительные последствия чрезмерного воспаления.
Согласно медицинской гипотезе, на которой основан протокол, молодые люди могут получить пользу от функциональной адаптации клеток врожденного иммунитета, вызванной эпигенетическим перепрограммированием, и, особенно, от ранее существовавшего «частично специфического» иммунитета к вирусам сообщества, вызванным «свидетелями». эффект» предшествующих прививок. В этом исследовании мы изучим основные различия, существующие между пациентами, инфицированными SARS-CoV-2, которые переносят заболевание в разной степени тяжести. Мы предполагаем распознавать разные популяции пациентов, каждая из которых имеет специфический иммунологический паттерн. Она могла различаться по уровню цитокинов, растворимых факторов в сыворотке крови и активности иммунных клеток как врожденного, так и приобретенного компартмента. Доказательство роли этих иммунологических явлений в патогенезе Covid-19 является основанием для проведения терапевтических иммуномодулирующих мероприятий. Кроме того, определение профиля иммунологического риска может адаптировать установленные методы лечения к каждому типу пациентов.
Обзор исследования
Статус
Подробное описание
Согласно медицинской гипотезе, на которой основан протокол, молодые люди могут получить пользу от функциональной адаптации клеток врожденного иммунитета, вызванной эпигенетическим перепрограммированием, и, особенно, от ранее существовавшего «частично специфического» иммунитета к вирусам сообщества, вызванным «свидетелями». эффект» предшествующих прививок. В этом исследовании мы изучим основные различия, существующие между пациентами, инфицированными SARS-CoV-2, которые переносят заболевание в разной степени тяжести. Мы предполагаем распознавать разные популяции пациентов, каждая из которых имеет специфический иммунологический паттерн. Она могла различаться по уровню цитокинов, растворимых факторов в сыворотке крови и активности иммунных клеток как врожденного, так и приобретенного компартмента.
Данные будут собираться с использованием 3 подходов:
- Экспериментальный анализ групп пациентов для изучения врожденного иммунного ответа и определения генетических профилей.
- Эпидемиологический анализ с целью выявления прививочного анамнеза пациентов;
- Клинический анализ для определения иммунологического профиля;
Для специфического анализа, изучения врожденного иммунного ответа и определения генетических профилей ученые проанализируют из периферической крови NK-клетки, моноциты, CD4 и CD8 T-клетки обеих групп: здоровые пациенты (тесты на SARS-CoV отрицательные). -2) и больных подгрупп (АС 19, PAU19, POL19, ARD19).
От разных групп пациентов образцы крови (10-15 мл) будут взяты в пробирки с ЭДТА, центрифугированы при 360 g в течение 10 минут для получения плазмы, которая будет храниться при -80°C для последующего анализа на интересующие цитокины и хемокины. с помощью ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 и CXCL10) в конце регистрации.
Осадки клеток возвращают к исходному объему с помощью PBS и разбавляют 1:1 (об./об.), а затем подвергают стратификации в градиенте плотности с Ficoll Histopaque-1077 при 500 г в течение 30 минут. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из белого кольца, собирают, дважды промывают в PBS, а затем используют для последующих экспериментов с использованием проточного цитометра (REFF). Культура in vitro с использованием PBMC может варьироваться от 1 дня ex vivo до нескольких дней, и клетки будут поддерживаться в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ l-глютамина, 100 ЕД/мл пенициллина. и 100 мкг/мл стрептомицина (P/S), при 37°C, 5% CO2.
Для проведения ex vivo анализа фенотипа с помощью флуоресцентно-активируемого сортировщика клеток (FACS) 2,5x105 свежих тотальных РВМС на пробирку FACS окрашивают в течение 30 минут при 4°C моноклональными антителами (мАт) следующим образом: CD3-PerCP, CD56-APC. , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. После настройки прямого/бокового рассеяния NK-клетки будут идентифицированы в две подгруппы клеток, то есть как CD3- и CD56dim CD16+ клетки (CD56dim NK-клетки, основное подмножество, около 90%) и CD3- и CD56bright CD16-/low клетки ( NK-клетки CD56bright, минорная субпопуляция, около 10%). Экспрессию других маркеров будут оценивать на обоих подмножествах закрытых клеток.
Для оценки ex vivo FACS анализа фенотипа моноцитов 2,5x105 свежих тотальных РВМС на пробирку FACS будут окрашивать в течение 30 минут при 4°C с помощью mAb следующим образом: CD45-APC, CD14-FITC и CD16-V450, PE-CD209, ПЭ-CD80. После настройки прямого/бокового рассеяния моноциты будут идентифицированы в три подгруппы, т. е. как клетки CD14+ и CD16- (основная подгруппа, около 90%), CD14+ CD16+ (второстепенная подгруппа, около 10%) и CD14-/низкая CD16+ (другое минорное подмножество).
Мы также оценим фенотип CD4 и CD8 Т-клеток и соотношение CD4/CD8 T, используя 2x105 свежих тотальных РВМС, как описано ранее, со следующими mAb: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450, а также регуляторные T (Treg ) клетки, как CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
PBMC также будут стимулировать in vitro в течение 4 часов различными типами стимулов, такими как LPS (распознаваемый TLR4), поли(I:C) (распознаваемый TLR3), поли(I:C) плюс IL-2 плюс IL-12 и ацетат форболмиристата (PMA) плюс иономицин в присутствии монензина и брефельдина. Эта процедура позволит изучить продукцию специфических цитокинов/хемокинов из NK-клеток и моноцитов с помощью внутриклеточного анализа FACS, как описано ранее (REFF). Для NK-клеток мы будем измерять IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE и CD107a-PE (маркер дегрануляции). Для моноцитов мы будем исследовать: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (провоспалительные маркеры типа M1) и TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -тип противовоспалительных маркеров) Всякий раз, когда количество РВМС будет достаточным, будут проведены другие функциональные тесты in vitro на NK-клетках и моноцитах. В частности, РВМС будут изучать на 4-часовую дегрануляцию/цитотоксическую функцию NK-клеток по отношению к эритролейкемической клеточной линии K562 с оценкой поверхности CD107a-PE с использованием проточного цитофлуориметрического анализа (REFF).
Всякий раз, когда количество PBMC становится достаточным, моноциты очищают с использованием анти-CD14-микрошариков с магнитным сепаратором и NK-клеток с помощью набора RosetteSep для получения > 90% очищенных клеточных популяций.
Очищенные моноциты и очищенные NK можно поддерживать отдельно или вместе в культуре с использованием среды RPMI 1640 с 10% FBS и с добавлением M-CSF и IL-2 соответственно, стимулировать различными стимулами (см. выше), а затем проверять на наличие внутриклеточных цитокинов. /интересующие хемокины (см. выше). В то же время супернатанты (кондиционированная среда, КС) могли быть собраны в конце инкубации культуры in vitro и оценены на цитокины/хемокины с помощью ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
4-5-дневную культуру моноцитов in vitro будут дополнительно стимулировать в течение 24 часов с помощью LPS плюс IFNg (стимул M1) или (IL-4) (стимул M2) для исследования поляризации макрофагов с изучением поверхностных маркеров M1 (TNF, CXCL10) или маркеров M2. (IL-10, CCL18) для проверки распространенности поляризации макрофагов в разных группах пациентов с Covid-19.
Эпидемиологический анализ будет проводиться с учетом как истории вакцинации, так и данных, ежедневно собираемых после госпитализации. Архивы ATS Insubria предоставят недостающие данные.
С учетом иммунологического профиля пациенты с Covid-19 будут проходить плановые обследования и следующее:
- иммунофенотипирование лимфоцитов;
- определение активности фракций комплемента С3 и С4;
- уровень иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA, IgE) в сыворотке крови;
- электрофорез белков сыворотки;
- Уровень ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) в сыворотке крови;
- серологический тест на ЦМВ (цитомегаловирус);
- Уровень ИЛ-6 в сыворотке.
Тип исследования
Регистрация (Ожидаемый)
Контакты и местонахождение
Места учебы
-
-
-
Varese, Италия, 21100
- Рекрутинг
- ATS Insubria
-
Контакт:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Номер телефона: +393398758024
- Электронная почта: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Главный следователь:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Главный следователь:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Младший исследователь:
- Domenico Iovino, MD
-
Младший исследователь:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Главный следователь:
- Giulio Carcano, Professor
-
Младший исследователь:
- Andreina Baj, MD
-
Младший исследователь:
- Walter Ageno, Professor
-
Младший исследователь:
- Francesco Acquati, Professor
-
Младший исследователь:
- Angelo Genoni, Dr
-
Младший исследователь:
- Denisa Baci, PhD
-
Младший исследователь:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Младший исследователь:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Младший исследователь:
- Elisa Monti, MD
-
Младший исследователь:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Младший исследователь:
- Caterina Franchi, MD
-
Младший исследователь:
- Valentina Iori, MD
-
Младший исследователь:
- Federica Masci, MD
-
-
Критерии участия
Критерии приемлемости
Возраст, подходящий для обучения
Принимает здоровых добровольцев
Полы, имеющие право на обучение
Метод выборки
Исследуемая популяция
Описание
Критерии включения:
- Возраст: ≥ 18 лет
- Задокументированная инфекция SARS-CoV-2
Критерий исключения:
- Отказ от подписания договора (информированное согласие);
- невозможность подписать соглашение;
- ВИЧ, ВГС, ВГВ (положительный на HBsAg) инфекция.
Учебный план
Как устроено исследование?
Детали дизайна
- Наблюдательные модели: Только для случая
- Временные перспективы: Перспективный
Когорты и вмешательства
Группа / когорта |
Вмешательство/лечение |
|---|---|
|
Положительный результат теста на SARS-CoV-2
Пациенты с положительным результатом теста на SARS-CoV-2 будут набраны в отделении неотложной помощи клинической больницы Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi в Варезе.
|
Фенотипический и функциональный анализ моноцитов и NK-клеток
|
Что измеряет исследование?
Первичные показатели результатов
Мера результата |
Мера Описание |
Временное ограничение |
|---|---|---|
|
Активность иммунных клеток
Временное ограничение: 6 месяцев
|
Гипотеза ученых заключается в том, что моноциты, NK, CD4 и CD8 Т-клетки у пациентов с тяжелой инфекцией SARS-CoV-2 демонстрируют нарушение своей функции: клетки проявляют непреодолимую гиперактивность, которая провоцирует патологический воспалительный ответ с массивным производством провоспалительные цитокины, отек и легочный фиброз.
|
6 месяцев
|
Вторичные показатели результатов
Мера результата |
Мера Описание |
Временное ограничение |
|---|---|---|
|
Защитные факторы и новые терапевтические стратегии
Временное ограничение: 6 месяцев
|
Второстепенные цели состоят в том, чтобы сопоставить клинические данные и историю вакцинации с лабораторным иммунным паттерном, чтобы определить защитные факторы для Covid-19 и открыть пути для новых терапевтических стратегий.
|
6 месяцев
|
Соавторы и исследователи
Следователи
- Учебный стул: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Главный следователь: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Главный следователь: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Публикации и полезные ссылки
Общие публикации
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Даты записи исследования
Изучение основных дат
Начало исследования (Действительный)
Первичное завершение (Ожидаемый)
Завершение исследования (Ожидаемый)
Даты регистрации исследования
Первый отправленный
Впервые представлено, что соответствует критериям контроля качества
Первый опубликованный (Действительный)
Обновления учебных записей
Последнее опубликованное обновление (Действительный)
Последнее отправленное обновление, отвечающее критериям контроля качества
Последняя проверка
Дополнительная информация
Термины, связанные с этим исследованием
Дополнительные соответствующие термины MeSH
Другие идентификационные номера исследования
- 67/2020
Планирование данных отдельных участников (IPD)
Планируете делиться данными об отдельных участниках (IPD)?
Информация о лекарствах и устройствах, исследовательские документы
Изучает лекарственный продукт, регулируемый FDA США.
Изучает продукт устройства, регулируемый Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
Эта информация была получена непосредственно с веб-сайта clinicaltrials.gov без каких-либо изменений. Если у вас есть запросы на изменение, удаление или обновление сведений об исследовании, обращайтесь по адресу register@clinicaltrials.gov. Как только изменение будет реализовано на clinicaltrials.gov, оно будет автоматически обновлено и на нашем веб-сайте. .