Ta strona została przetłumaczona automatycznie i dokładność tłumaczenia nie jest gwarantowana. Proszę odnieść się do angielska wersja za tekst źródłowy.

Aktywność monocytów i komórek NK u pacjentów z Covid-19

3 maja 2020 zaktualizowane przez: Ietto Giuseppe, Università degli Studi dell'Insubria

Badanie mechanizmów o podłożu immunologicznym u pacjentów z pozytywnym wynikiem testu na obecność SARS-CoV-2: analiza fenotypowa i funkcjonalna monocytów i komórek NK we krwi osób dotkniętych Covid-19

SARS-CoV-2 należy do rodziny beta-koronawirusów, a jego droga przenoszenia i objawy są podobne do wszystkich koronawirusów nabytych poza społecznością. Główną różnicą nowego koronawirusa jest wyższa śmiertelność, która wynosi około 3%.

Śmiertelność przekracza 1% tylko dla pacjentów powyżej 50 roku życia, natomiast do 40 roku życia wynosi poniżej 0,4%. Jak dotąd nie odnotowano ofiar śmiertelnych wśród dzieci poniżej 10 roku życia. Śmiertelność jest prawie dwukrotnie wyższa wśród mężczyzn niż wśród kobiet. Ten rozkład śmiertelności w zależności od wieku zakażonych pacjentów można tylko częściowo przypisać innym chorobom współistniejącym oprócz dużego wieku. W rzeczywistości u pacjentów, u których wcześniej nie występowały choroby, wskaźnik śmiertelności wynosi 0,9%.

Niemal zerowy odsetek ciężkich chorób u dzieci i ogólnie u pacjentów w wieku poniżej 40 lat jest zupełnie niewytłumaczalny. Niemowlęta, dzieci i młodzież mogą zostać zarażone, ale infekcja szybko ustępuje samoistnie lub bezobjawowo. Starsi pacjenci doznają ciężkiego uszkodzenia płuc w wyniku opóźnionej odpowiedzi immunologicznej.

Możliwym wyjaśnieniem tych zjawisk może być coś, co zapewnia zdolność do szybkiej reakcji na SARS-CoV-2 u młodszych osób niezależnie od nowości samego wirusa.

Wydawać by się mogło, że osoby młodsze są już uczulone na antygeny wirusa bez wcześniejszego kontaktu.

Odporność ta nie jest tak naprawdę specyficzna, lecz „częściowo specyficzna” dla wielu antygenów wirusa, jednak zdolna do ograniczenia infekcji w organizmie. Coś pobudziło układ odpornościowy i rozproszyło odporność na coraz więcej obecnych antygenów. Dzieci są grupą wiekową najbardziej narażoną na wszystkie krążące w społeczności wirusy.

Ta odporność nie jest trwała, ale stopniowo zanika. Chroni od drugiego roku życia, kiedy dochodzi do hipotetycznej stymulacji, do piątej dekady życia, ze względu na jej powolny spadek.

Jedyną zewnętrzną stymulacją, jaką otrzymują zdrowi ludzie, są szczepionki. Wszystkie szczepienia, a zwłaszcza przeciw tężcowi, toksoidom błoniczym i inaktywowanym bakteriom, takim jak krztusiec, mogą stymulować układ odpornościowy. Rozwijają odporność specyficzną, ale generują również kiełkującą odporność na antygeny w tranzycie, takie jak koronawirusy i inne krążące w społeczności wirusy.

Wykształcona odporność zapewnia pewną ochronę przed licznymi infekcjami wirusowymi przez lata, aż do naturalnego zaniku.

Po piątej dekadzie ta odporność jest wolniej przywracana i reaktywowana. Dodatkowo biorcy przeszczepów i pacjenci zakażeni wirusem HIV, u których układ odpornościowy jest zahamowany, nieoczekiwanie wydają się nie cierpieć z powodu najgorszych powikłań zakażenia SARS-CoV-2. Zaburzenie równowagi układu odpornościowego może odgrywać kluczową rolę podczas reakcji na wirusa, ograniczając destrukcyjne skutki nadmiernego stanu zapalnego.

Zgodnie z hipotezą medyczną, na której oparty jest protokół, młodzi ludzie mogliby odnieść korzyść z funkcjonalnej adaptacji wrodzonych komórek odpornościowych indukowanej przez przeprogramowanie epigenetyczne, a zwłaszcza z istniejącej wcześniej „częściowo swoistej” odporności na wirusy społeczności, wywołanej przez „osobę postronną”. efekt" poprzednich szczepień. W tym badaniu zbadamy główne różnice istniejące między pacjentami zakażonymi SARS-CoV-2, którzy doświadczają choroby w różnym stopniu nasilenia. Przypuszczamy, że rozpoznajemy różne populacje pacjentów, z których każda ma określony wzorzec immunologiczny. Może się różnić pod względem cytokin, poziomu czynników rozpuszczalnych w surowicy oraz aktywności komórek odpornościowych zarówno przedziału wrodzonego, jak i nabytego. Dowodem na rolę tych zjawisk immunologicznych w patogenezie Covid-19 są podstawy do wdrożenia terapeutycznych terapii immunomodulujących. Ponadto definicja profilu ryzyka immunologicznego mogłaby dostosować ustalone terapie do każdego rodzaju pacjenta.

Przegląd badań

Status

Nieznany

Warunki

Interwencja / Leczenie

Szczegółowy opis

Zgodnie z hipotezą medyczną, na której oparty jest protokół, młodzi ludzie mogliby odnieść korzyść z funkcjonalnej adaptacji wrodzonych komórek odpornościowych indukowanej przez przeprogramowanie epigenetyczne, a zwłaszcza z istniejącej wcześniej „częściowo swoistej” odporności na wirusy społeczności, wywołanej przez „osobę postronną”. efekt" poprzednich szczepień. W tym badaniu zbadamy główne różnice istniejące między pacjentami zakażonymi SARS-CoV-2, którzy doświadczają choroby w różnym stopniu nasilenia. Przypuszczamy, że rozpoznajemy różne populacje pacjentów, z których każda ma określony wzorzec immunologiczny. Może się różnić pod względem cytokin, poziomu czynników rozpuszczalnych w surowicy oraz aktywności komórek odpornościowych zarówno przedziału wrodzonego, jak i nabytego.

Dane będą gromadzone przy użyciu 3 podejść:

  • Analiza eksperymentalna dla grup pacjentów w celu zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i identyfikacji profili genetycznych.
  • Analiza epidemiologiczna w celu ustalenia historii szczepień pacjentów;
  • Analiza kliniczna w celu wykrycia profilu immunologicznego;

W celu przeprowadzenia szczegółowej analizy, zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i identyfikacji profili genetycznych, naukowcy przeanalizują z krwi obwodowej komórki NK, monocyty, limfocyty T CD4 i CD8 obu grup: zdrowych pacjentów (z wynikiem negatywnym na obecność SARS-CoV -2) i chorych z podgrup (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

Od różnych grup pacjentów próbki krwi (10-15 ml) zostaną pobrane do probówek z EDTA, odwirowane przy 360 g przez 10 minut w celu uzyskania osocza, które będzie przechowywane w temperaturze -80°C do późniejszej analizy pod kątem cytokin i chemokin będących przedmiotem zainteresowania testem ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 i CXCL10) na koniec rejestracji.

Osady komórek zostaną przywrócone do początkowej objętości za pomocą PBS i rozcieńczone 1:1 (obj./obj.), a następnie poddane stratyfikacji w gradiencie gęstości za pomocą Ficoll Histopaque-1077, przy 500 g przez 30 minut. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) pochodzące z białego pierścienia zostaną zebrane, przemyte dwukrotnie w PBS, a następnie użyte do kolejnych eksperymentów z wykorzystaniem testu cytometrii przepływowej (REFF). Hodowla in vitro przy użyciu PBMC może trwać od 1 dnia do kilku dni ex vivo, a komórki będą utrzymywane w pożywce RPMI 1640, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM l-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P/S), w 37°C, 5% CO2.

W celu przeprowadzenia analizy fenotypowej sortera aktywowanego fluorescencją komórek (FACS) ex vivo, 2,5x105 świeżych całkowitych PBMC na probówkę FACS będzie barwione przez 30 minut w temperaturze 4°C przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) w następujący sposób: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Po ustawieniu Forward/Side Scatter komórki NK zostaną zidentyfikowane na dwa podzbiory komórek, tj. jako komórki CD3- i CD56dim CD16+ (komórki CD56dim NK, główny podzbiór, około 90%) oraz komórki CD3- i CD56bright CD16-/low ( Komórki CD56bright NK, mniejszy podzbiór, około 10%). Ekspresja innych markerów zostanie oceniona na obu podzbiorach bramkowanych komórek.

W celu oceny ex vivo FACS analizy fenotypu monocytów, 2,5x105 świeżych całkowitych PBMC na probówkę FACS będzie barwione przez 30 minut w temperaturze 4°C następującymi mAb: CD45-APC, CD14-FITC i CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Po ustawieniu Forward/Side Scatter, monocyty zostaną podzielone na trzy podzbiory, tj. jako komórki CD14+ i CD16- (główny podzbiór, około 90%), CD14+ CD16+ (mniejszy podzbiór, około 10%) i CD14-/niski CD16+ (inny podzbiór podrzędny).

Ocenimy również fenotyp limfocytów T CD4 i CD8 oraz stosunek T CD4/CD8 przy użyciu 2x105 świeżych całkowitych PBMC, jak opisano wcześniej, z następującymi mAb: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450, a także regulatorem T (Treg ) komórki, jak CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

PBMC będą również stymulowane in vitro przez 4 godziny różnymi typami bodźców, takimi jak LPS (rozpoznawany przez TLR4), poli(I:C) (rozpoznawany przez TLR3), poli(I:C) plus IL-2 plus IL-12 i octan mirystynianu forbolu (PMA) plus jonomycyna w obecności monenzyny i brefeldyny. Ta procedura pozwoli na badanie wytwarzania specyficznych cytokin/chemokin z komórek NK i monocytów przy użyciu wewnątrzkomórkowego testu FACS, jak opisano wcześniej (REFF). W przypadku komórek NK zmierzymy IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE i CD107a-PE (marker degranulacji). Dla monocytów zbadamy: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (markery prozapalne typu M1) oraz TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (markery M2 markery przeciwzapalne) Gdy tylko ilość PBMC będzie wystarczająca, zostaną uruchomione inne testy czynnościowe in vitro na komórkach NK i monocytach. W szczególności, PBMC będą badane pod kątem 4-godzinnej degranulacji komórek NK/funkcji cytotoksycznej wobec erytroleucemicznej linii komórkowej K562, oceniając powierzchnię CD107a-PE przy użyciu testu cytofluorymetrii przepływowej (REFF).

Gdy ilość PBMC jest wystarczająca, monocyty zostaną oczyszczone przy użyciu mikrokulek anty-CD14 z separatorem magnetycznym i komórek NK z zestawem RosetteSep w celu uzyskania >90% oczyszczonych populacji komórek.

Oczyszczone monocyty i oczyszczony NK można hodować osobno lub razem w hodowli przy użyciu pożywki RPMI 1640 z 10% FBS i uzupełnionej odpowiednio M-CSF i IL-2, stymulować różnymi bodźcami (patrz powyżej), a następnie sprawdzać pod kątem cytokin wewnątrzkomórkowych /chemokiny będące przedmiotem zainteresowania (patrz powyżej). W tym samym czasie supernatanty (pożywka kondycjonowana, CM) można było zbierać pod koniec hodowli inkubacyjnej in vitro i oceniać pod kątem cytokin/chemokin za pomocą testu ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).

4-5 dniowa hodowla monocytów in vitro będzie dalej stymulowana przez 24 godziny LPS plus IFNg (bodziec M1) lub (IL-4) (bodziec M2) w celu zbadania polaryzacji makrofagów poprzez badanie powierzchniowych markerów M1 (TNF, CXCL10) lub markerów M2 (IL-10, CCL18) w celu sprawdzenia rozpowszechnienia polaryzacji makrofagów w różnych grupach pacjentów z Covid-19.

Przeprowadzona zostanie analiza epidemiologiczna obejmująca zarówno historię szczepień, jak i dane zbierane codziennie po przyjęciu do szpitala. Archiwa ATS Insubria uzupełnią brakujące dane.

Biorąc pod uwagę profil immunologiczny, pacjenci z Covid-19 będą poddani rutynowym badaniom oraz:

  • immunofenotypowanie limfocytów;
  • oznaczanie aktywności frakcji dopełniacza C3 i C4;
  • poziom immunoglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE) w surowicy;
  • elektroforeza białek surowicy;
  • poziom enzymu konwertującego angiotensynę (ACE) w surowicy;
  • test serologiczny CMV (Citomegalovirus);
  • Poziom IL-6 w surowicy.

Typ studiów

Obserwacyjny

Zapisy (Oczekiwany)

150

Kontakty i lokalizacje

Ta sekcja zawiera dane kontaktowe osób prowadzących badanie oraz informacje o tym, gdzie badanie jest przeprowadzane.

Lokalizacje studiów

  • Włochy
      • Varese, Włochy, 21100
        • Rekrutacyjny
        • ATS Insubria
        • Kontakt:
        • Główny śledczy:
          • Giuseppe Ietto, MD
        • Główny śledczy:
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • Pod-śledczy:
          • Domenico Iovino, MD
        • Pod-śledczy:
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • Główny śledczy:
          • Giulio Carcano, Professor
        • Pod-śledczy:
          • Andreina Baj, MD
        • Pod-śledczy:
          • Walter Ageno, Professor
        • Pod-śledczy:
          • Francesco Acquati, Professor
        • Pod-śledczy:
          • Angelo Genoni, Dr
        • Pod-śledczy:
          • Denisa Baci, PhD
        • Pod-śledczy:
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • Pod-śledczy:
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • Pod-śledczy:
          • Elisa Monti, MD
        • Pod-śledczy:
          • Andrea Vigezzi, MD
        • Pod-śledczy:
          • Caterina Franchi, MD
        • Pod-śledczy:
          • Valentina Iori, MD
        • Pod-śledczy:
          • Federica Masci, MD

Kryteria uczestnictwa

Badacze szukają osób, które pasują do określonego opisu, zwanego kryteriami kwalifikacyjnymi. Niektóre przykłady tych kryteriów to ogólny stan zdrowia danej osoby lub wcześniejsze leczenie.

Kryteria kwalifikacji

Wiek uprawniający do nauki

18 lat i starsze (Dorosły, Starszy dorosły)

Akceptuje zdrowych ochotników

Nie

Płeć kwalifikująca się do nauki

Wszystko

Metoda próbkowania

Próbka bez prawdopodobieństwa

Badana populacja

Pacjenci z pozytywnym wynikiem testu na obecność SARS-CoV-2

Opis

Kryteria przyjęcia:

  • Wiek: ≥ 18 lat
  • Udokumentowane zakażenie SARS-CoV-2

Kryteria wyłączenia:

  • Odmowa podpisania umowy (świadoma zgoda);
  • Brak możliwości podpisania umowy;
  • Zakażenie HIV, HCV, HBV (dodatni na HBsAg).

Plan studiów

Ta sekcja zawiera szczegółowe informacje na temat planu badania, w tym sposób zaprojektowania badania i jego pomiary.

Jak projektuje się badanie?

Szczegóły projektu

  • Modele obserwacyjne: Tylko przypadek
  • Perspektywy czasowe: Spodziewany

Kohorty i interwencje

Grupa / Kohorta
Interwencja / Leczenie
Pozytywny wynik testu na SARS-CoV-2
Pacjenci, u których uzyskano pozytywny wynik testu na obecność SARS-CoV-2, będą rekrutowani na ostry dyżur Szpitala Klinicznego „Ospedale Di Circolo – ASST Settelaghi” w Varese.
Test diagnostyczny: Badanie mechanizmów immunologicznych u pacjentów z dodatnim wynikiem testu na obecność SARS-CoV-2
Analiza fenotypowa i funkcjonalna monocytów i komórek NK

Co mierzy badanie?

Podstawowe miary wyniku

Miara wyniku
Opis środka
Ramy czasowe
Aktywność komórek odpornościowych
Ramy czasowe: 6 miesięcy
Hipoteza naukowców jest taka, że ​​monocyty, limfocyty T NK, CD4 I CD8 u pacjentów z ciężką infekcją SARS-CoV-2 wykazują upośledzenie swojej funkcji: komórki wykazują nadmierną nadaktywność, która wywołuje patologiczną odpowiedź zapalną z masową produkcją cytokiny prozapalne, obrzęk i zwłóknienie płuc.
6 miesięcy

Miary wyników drugorzędnych

Miara wyniku
Opis środka
Ramy czasowe
Czynniki ochronne i nowe strategie terapeutyczne
Ramy czasowe: 6 miesięcy
Drugim celem jest skorelowanie danych klinicznych i historii szczepień z laboratoryjnym wzorcem odpornościowym w celu zidentyfikowania czynników ochronnych dla Covid 19 i otwarcia ścieżek dla nowych strategii terapeutycznych.
6 miesięcy

Współpracownicy i badacze

Tutaj znajdziesz osoby i organizacje zaangażowane w to badanie.

Sponsor

Università degli Studi dell'Insubria

Śledczy

  • Krzesło do nauki: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
  • Główny śledczy: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
  • Główny śledczy: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria

Publikacje i pomocne linki

Osoba odpowiedzialna za wprowadzenie informacji o badaniu dobrowolnie udostępnia te publikacje. Mogą one dotyczyć wszystkiego, co jest związane z badaniem.

Publikacje ogólne

Daty zapisu na studia

Daty te śledzą postęp w przesyłaniu rekordów badań i podsumowań wyników do ClinicalTrials.gov. Zapisy badań i zgłoszone wyniki są przeglądane przez National Library of Medicine (NLM), aby upewnić się, że spełniają określone standardy kontroli jakości, zanim zostaną opublikowane na publicznej stronie internetowej.

Główne daty studiów

Rozpoczęcie studiów (Rzeczywisty)

27 kwietnia 2020

Zakończenie podstawowe (Oczekiwany)

30 czerwca 2020

Ukończenie studiów (Oczekiwany)

31 października 2020

Daty rejestracji na studia

Pierwszy przesłany

3 maja 2020

Pierwszy przesłany, który spełnia kryteria kontroli jakości

3 maja 2020

Pierwszy wysłany (Rzeczywisty)

5 maja 2020

Aktualizacje rekordów badań

Ostatnia wysłana aktualizacja (Rzeczywisty)

5 maja 2020

Ostatnia przesłana aktualizacja, która spełniała kryteria kontroli jakości

3 maja 2020

Ostatnia weryfikacja

1 maja 2020

Więcej informacji

Terminy związane z tym badaniem

Dodatkowe istotne warunki MeSH

Inne numery identyfikacyjne badania

  • 67/2020

Plan dla danych uczestnika indywidualnego (IPD)

Planujesz udostępniać dane poszczególnych uczestników (IPD)?

Niezdecydowany

Informacje o lekach i urządzeniach, dokumenty badawcze

Bada produkt leczniczy regulowany przez amerykańską FDA

Nie

Bada produkt urządzenia regulowany przez amerykańską FDA

Nie

Te informacje zostały pobrane bezpośrednio ze strony internetowej clinicaltrials.gov bez żadnych zmian. Jeśli chcesz zmienić, usunąć lub zaktualizować dane swojego badania, skontaktuj się z register@clinicaltrials.gov. Gdy tylko zmiana zostanie wprowadzona na stronie clinicaltrials.gov, zostanie ona automatycznie zaktualizowana również na naszej stronie internetowej .

Badania kliniczne na COVID-19

Wyszukaj podobne próby

Sponsorzy i współpracownicy

Warunki medyczne

Interwencje lekowe

CROs by country

CROs in Belarus

Warunki

Rzadkie choroby

Interwencje lekowe

Suplementy diety

Sponsor / Współpracownicy

Lokalizacje

Subskrybuj