食道扁平上皮がんのマイクロバイオーム

食道がんは、世界のがん関連死の 6 番目の主要な原因として、世界のがん負担ランキングに大きく貢献しています。 食道扁平上皮がん (OESCC) は、世界のいくつかの地域、特にアジアの中国と日本で最も一般的なタイプの上部消化管 (UGI) がんの 1 つです。 この疾患の予後は非常に悪く、5 年生存率は全体で 30% 未満です。これは、主に診断の後期段階であり、遠隔転移の可能性が高いためです。 OESCC は喫煙やアルコールなどの危険因子と関連していますが、OESCC の病因はまだよくわかっていません。

増加する証拠は、発癌における細菌微生物叢の重要な役割を示しています。 新たなデータは、ヒトのマイクロバイオームがさまざまな癌に関係していることを示しており、最も顕著なのは結腸直腸癌のフソバクテリウムと胃癌のヘリコバクターです。 消化管にコロニーを形成する細菌マイクロバイオームのコンソーシアムは広範であり、複雑な方法で相互作用します。 マイクロバイオームは、遺伝的および環境的要因と相互作用して、他の機能の中でも、食事成分や生体異物を代謝する可能性があります。 微生物のバランスが乱れると、微生物叢は宿主細胞の増殖と死を変化させ、免疫系を操作し、宿主の代謝に影響を与え、癌を引き起こす可能性があります. いくつかの研究では、上部消化管癌におけるヒト微生物叢の重要な役割が報告されており、微生物叢と、食道炎やバレット食道などのUGI管のいくつかの疾患、食道の扁平上皮異形成および扁平上皮癌との関連が見出されています。 さらにあまり知られていないもう 1 つのことは、OESCC における真菌マイクロバイオームの役割です。

ここで研究者は、OESCC における細菌と真菌のマイクロバイオームの役割と、OESCC の理解と管理に役割を果たす可能性のある宿主微生物の相互作用を評価しようとします。

研究の質問:

1. OESCC 患者と正常患者ではマイクロバイオームに違いはありますか?
2. マイクロバイオームは、正常な状態から前癌状態から悪性状態へと変化しますか?
3. マイクロバイオームと OESCC の発生または進行に関与するメカニズムは何ですか?

研究デザイン:

これは前向き研究です。 この調査は、ヘルシンキ宣言に従って実施されます。

患者は、2020 年 6 月から 2025 年 5 月までプリンス オブ ウェールズ病院から募集されます。新たに診断された OESCC または食道扁平上皮異形成症の 100 人の患者が試験群に募集されます。 悪性腫瘍の病歴のない食道胃十二指腸鏡検査 (OGD) を受けている 100 人の患者を対照群に募集します。 -被験者の参加の予想期間は2か月未満です。

この研究には、次のように 2 回の訪問があります。

1. 訪問 1:

   私。プロジェクトについて話し合い、インフォームド コンセント フォームに署名する。 ii. オーラルリンス20mlを集めるには; iii. アンケートに記入するには: 腸内微生物 - 医療と健康に関するアンケート。

2. 訪問 2:

OGDを持っています。 訪問 2 は、訪問 1 から 2 か月以内に実施され、治療の前に行う必要があります。

私。試験群：腫瘍の生検による病変の検査、隣接する正常組織の生検、通常の生理食塩水によるフラッシュ。

ii. 対照群: 正常組織の生検を行い、生理食塩水でフラッシュします。

サンプルサイズの正当化:

これは、OESCC に基づく以前のデータがない前向き研究です。 しかし、頭頸部扁平上皮癌 (HNSCC) のデータに基づいて、伝統的な危険因子と重複する部分があり、研究者は少なくとも 100 人の OESCC 患者と 100 人の健康な被験者を募集することを目標としています。 54のHNSCC腫瘍組織と隣接する正常組織を使用したHNSCC研究では、症例と対照を区別できる16S rRNAショートリードが生成されました。 平均相対存在量が 0.1% を超える合計 77 の細菌属が、腫瘍組織で観察されました。 希薄化分析は、35 のサンプルのいずれかから少なくとも 73 の属を検出できることを示しており、100 人の患者と 100 人のコントロールの募集が、口腔細菌のほぼ完全なスペクトルを含む最小化されたサンプルサイズを満たし、検出力が 0.8 であると予想されることを示唆しています。ケースとコントロールの間の口腔微生物叢の異常を特徴付ける95％の信頼レベル。

独立変数

以下の独立変数を調べて、メチル化パネルと OESCC の関連性を評価します。

1. 臨床的要因：疾患のTNM病期分類、併存疾患。
2. がんの危険因子：喫煙歴、アルコール消費。
3. 患者要因：性別、年齢。
4. 組織学的特徴：腫瘍の深さ、被膜外への広がり、リンパ管浸潤、神経周囲浸潤。

サンプル:

口腔リンス：手順の前に、すべての患者に20mlの生理食塩水で口腔をすすぐように指示することにより、口腔リンスが実行されます。 結果として得られる解は、その後の分析のために保持されます。

内視鏡処置 内視鏡処置は、上部内視鏡検査の専門知識を持つ医師によって行われます。 プリンスオブウェールズ病院の複合内視鏡センターで実施されます。 局所局所麻酔薬が中咽頭に適用されます。 拡大/デュアルフォーカスと NBI 機能を備えた内視鏡が使用されます。 焦点距離をより適切に調整できるように、柔らかい黒いフードが内視鏡の先端に取り付けられます。

次に、試験群の患者は内視鏡検査を受け、腫瘍の生検が 1 回、隣接する正常な食道粘膜の生検が 1 回行われます。 さらに、食道を20mlの通常の生理食塩水で穏やかに洗い流すことによって食道のすすぎも行い、流体を吸引して分析のために収集した。

対照群の患者は、通常の臨床診療に従って内視鏡検査を受ける。 1 つの生検は、分析のために正常な食道粘膜から採取されます。 同様に、食道洗浄が行われる。

実験 DNA 抽出と亜硫酸水素塩修飾: 顕微解剖した新鮮な組織と唾液からの DNA をフェノール-クロロホルムで抽出し、100% エタノールで沈殿させ、5100 rpm で 45 分間遠心分離し、70% エタノールで 2 回洗浄し、LoTE バッファー (10mM TRIS) に溶解します。塩酸塩、1mM EDTA バッファー、pH 8)、-80°C で保存。

RNA 抽出: 新鮮な組織は、RNA の抽出のために RNAlater に保存され、-80°C で保存されます。

ゲノム解析: コピー数の異常と単一ヌクレオチドのバリエーションの次世代シーケンス解析を利用して、前述のようにショットガン大規模並列シーケンスを使用して収集されたサンプルを解析します。 また、シーケンスを使用して、コホートの微生物叢を分析します。 細菌の 16S rRNA 遺伝子配列決定: DNA のアリコートを使用して、16S rRNA 遺伝子 V3-V4 領域アンプリコン配列決定を使用して口腔微生物群集をスクリーニングします 24. 最新の Silva リボソーム RNA データベースを備えた QIIME2 を使用して、アンプリコン シーケンス バリアントを分類し、サンプルごとの細菌読み取りの割合を示す操作上の分類表を使用します。 菌類 ITS 遺伝子配列決定: 菌類の内部転写スペーサー遺伝子 (ITS) をターゲットにして、口腔真菌群集を特徴付けます。 ITS1 の短い領域 (~270 bp) を PCR で増幅し、MiSeq を使用して配列決定します。 読み取りは真菌 UNITE データベースに対して処理され、統計分析のために種、属、および OTU レベルで分類表が生成されます。

発現解析: 研究者は、免疫組織化学染色 (IHC) およびタンパク質アレイによるタンパク質プロファイリングを使用して、これらのゲノム変化した腫瘍がシグナル伝達タンパク質に特異的な変化を発現しているかどうかを判断します。 FFPE 切片または凍結組織は、IHC 分析またはタンパク質プロファイリングのためのゲノム特性解析研究と並行して採取されます。 IHC 分析またはタンパク質プロファイリングの場合、以前に公開されたように、合計 5 つの FFPE スライドが IHC またはタンパク質プロファイリングのタンパク質抽出に使用されます。 RNA を抽出し、RNA-seq、発現アレイ、RT-PCR 分析を含む RNA 分析に供して、食道腫瘍の特定の遺伝子発現パターン、および潜在的なバイオマーカーの発現を決定します。

細菌培養: OESCC におけるバイオマーカーとしてのマイクロバイオームの役割をさらに理解するために、シーケンシングで同定された細菌が腫瘍で有意に濃縮されるように組織標本を培養します。 組織標本を使い捨てメスで無菌的に浸軟し、ＰＢＳ（５００μｌ）中で３０秒間ボルテックスし、純粋な懸濁液を使用して１０倍希釈物を作製した ２） 。 きれいな懸濁液 (50 μl) をそれぞれ、血液寒天 (BA)、嫌気性嫌気性寒天 (FAA) (BA および FAA に 5% 脱繊維ヒツジの血液を添加; TCS Biosciences Ltd.)、およびサブロー寒天 (Lab MTM; International Diagnostics Group) に広げました。 plc)。 検体の希釈液と最終の PBS 洗浄液 (上記参照) を BA と FAA に広げました。 BAおよびサブロー寒天プレートを37℃で48時間好気的にインキュベートした。 FAAプレートを嫌気性キャビネット内で36°Cで96時間インキュベートしました。

アウトカム対策

1. 局所再発のない生存期間は、診断時から再発時まで、局所的、局所的、または局所的および局所的に記録されます。
2. 疾患特異的生存率は、診断時から OESCC による死亡時まで記録されます。
3. 全生存期間は、診断時からすべての原因による死亡時まで記録されます。

微生物、手術治療、および個人のメタデータ (性別、年齢、喫煙、飲酒、T/N ステージ、生存率、再発率など) の間の統計分析関連は、順序付け、ノンパラメトリック多変量分散分析、行列相関、カイ 2 乗検定、一般化線形モデル、または条件付きロジスティック回帰モデル。 最終的なバイオマーカーのパフォーマンスは、相互検証によって評価され、ROC 曲線を使用してモデルと比較グループ間の一致を評価するために c-index スコアによって要約されます。 BenjaminiHochenberg 法を使用して FDR を計算することにより、すべての複数のテスト補正が実行され、調整された p 値 < 0.05 は統計的に有意と見なされます。