Mikrobiomet til esophageal plateepitelkarsinom

Øsofaguskarsinom bidrar betydelig til den globale kreftbyrden rangering som den sjette ledende årsaken til global kreftrelatert død. Esophageal plateepitelkarsinom (OESCC) er en av de vanligste typene øvre gastrointestinale (UGI) karsinomer i noen regioner globalt, spesielt Kina og Japan i Asia. Sykdommen har en ekstremt dårlig prognose, med en samlet 5-års overlevelse på mindre enn 30 %, hovedsakelig på grunn av sent stadium ved diagnose og høy sannsynlighet for fjernmetastaser. Selv om OESCC er assosiert med risikofaktorer inkludert røyking og alkohol, er etiologien til OESCC fortsatt dårlig forstått.

Økende bevis indikerer en nøkkelrolle for bakteriell mikrobiota i karsinogenese. Nye data impliserer det menneskelige mikrobiomet i en rekke kreftformer, spesielt Fusobacterium i tykktarmskreft og Helicobacter i magekreft. Konsortiet av bakteriell mikrobiom som koloniserer mage-tarmkanalen er omfattende og samhandler på en kompleks måte. Mikrobiomet kan interagere med genetiske og miljømessige faktorer for å metabolisere kostholdsbestanddeler og xenobiotika, blant andre funksjoner. Når den mikrobielle balansen er forstyrret, kan mikrobiotaen endre vertscelleproliferasjon og død, manipulere immunsystemet og påvirke vertsmetabolismen, noe som gir opphav til karsinom. Flere studier har rapportert en viktig rolle for den menneskelige mikrobiotaen i øvre gastrointestinal karsinom og funnet assosiasjoner mellom mikrobiotaen og noen sykdommer i UGI-kanalen, slik som øsofagitt og Barrett-øsofagus, og med plateepiteldysplasi og plateepitelkarsinom i spiserøret. En annen enda mindre kjent er rollen til soppmikrobiomet i OESCC.

Her vil etterforskerne søke å evaluere rollen til bakterie- og soppmikrobiomet i OESCC og vertsmikrobeinteraksjonene som kan spille en rolle i forståelsen og håndteringen av OESCC.

Studiespørsmål:

1. Er mikrobiomet forskjellig mellom OESCC og normale pasienter?
2. Endrer mikrobiomet seg fra normalt gjennom premalignitet til malignitet?
3. Hva er mekanismene involvert i mikrobiomet og utviklingen eller progresjonen av OESCC?

Studere design:

Dette er en prospektiv studie. Studien vil bli utført i samsvar med Helsinki-erklæringen.

Pasienter vil bli rekruttert fra Prince of Wales Hospital fra juni 2020 til mai 2025. 100 pasienter med nylig diagnostisert OESCC eller oesophageal squamous dysplasi vil bli rekruttert til testgruppen. 100 pasienter som gjennomgår en oesophagogastroduodenoscopy (OGD) uten tidligere malignitet vil bli rekruttert til kontrollgruppen. Forventet varighet av fagdeltakelse er mindre enn to måneder.

Studien har to besøk, som følger:

1. Besøk 1:

   Jeg. For å diskutere om prosjektet og signere skjemaet for informert samtykke; ii. For å samle munnskylling 20ml; iii. For å fylle ut spørreskjema: Gut Microbe - Medisinsk og helse spørreskjema.

2. Besøk 2:

Å ha OGD. Besøk 2 vil bli utført innen to måneder etter besøk 1 og må før behandling.

Jeg. Testgruppe: Med undersøkelse av lesjonen med biopsi av svulst, biopsi av tilstøtende normalt vev, spyling med vanlig saltvann.

ii. Kontrollgruppe: Vil ta en biopsi av normalt vev og skylle med vanlig saltvann.

Prøvestørrelsesbegrunnelse:

Dette er en prospektiv studie uten tidligere data basert på OESCC. Men basert på data fra plateepitelkarsinom i hode og nakke (HNSCC) med en viss overlapping i tradisjonelle risikofaktorer, sikter etterforskerne mot å rekruttere minst 100 OESCC-pasienter og 100 friske forsøkspersoner. I HNSCC-studie med bruk av 54 HNSCC-svulstvev og tilstøtende normale vev har det generert 16S rRNA-kortlesninger i stand til å skille tilfeller fra kontroller. Totalt 77 bakterieslekter med >0,1 % gjennomsnittlig relativ overflod ble observert i tumorvev. En sjeldenhetsanalyse indikerte at minst 73 slekter kan påvises fra hvilken som helst av 35 prøver, noe som tyder på at rekruttering av 100 pasienter og 100 kontroller oppfyller den minimaliserte prøvestørrelsen for å inneholde nesten hele spekteret av orale bakterier og forventes å ha en styrke på 0,8 og konfidensnivå på 95 % for å karakterisere oral mikrobiota dysbiose mellom tilfeller og kontroller.

Uavhengige variabler

Følgende uavhengige variabler vil bli undersøkt for å evaluere assosiasjonen til metyleringspanelet og OESCC:

1. Kliniske faktorer: TNM stadieinndeling av sykdom, komorbiditeter;
2. Kreftrisikofaktorer: røykehistorie, alkoholforbruk;
3. Pasientfaktorer: kjønn, alder;
4. Histologiske egenskaper: tumordybde, ekstrakapsulær spredning, lymfovaskulær invasjon, perineural invasjon.

Prøver:

Munnskylling: Før prosedyren vil en munnskylling bli utført ved å be alle pasienter om å skylle munnhulen med 20 ml vanlig saltvann. Den resulterende løsningen vil beholdes for påfølgende analyse.

Endoskopiske prosedyrer Endoskopiske prosedyrer vil bli utført av leger med ekspertise på å utføre øvre endoskopi. Det vil bli utført ved Combined Endoscopy Center, Prince of Wales Hospital. Lokal lokalbedøvelse vil bli påført orofarynx. Endoskoper med forstørrelse/dobbeltfokus og NBI-funksjon vil bli brukt. En myk svart hette vil bli festet til spissen av endoskopet for bedre justering av brennvidde.

Pasienter i testgruppen ville deretter gjennomgå endoskopi med én biopsi av svulsten og én biopsi av den tilstøtende normale esophageal slimhinne. I tillegg vil øsofagusskylling også utføres ved å skylle spiserøret forsiktig med 20 ml vanlig saltvann og væsken suges og samles opp for analyse.

Pasienter i kontrollgruppen vil gjennomgå endoskopi i henhold til vanlig klinisk praksis. Én biopsi vil bli tatt fra normal esophageal slimhinne for analyse. På samme måte vil esophageal skylling bli utført.

Eksperimenter DNA-ekstraksjon og bisulfittmodifikasjon: DNA fra mikrodissekert ferskt vev og spytt vil bli ekstrahert med fenol-kloroform, presipitert i 100 % etanol, sentrifugert ved 5100 rpm i 45 minutter, vasket i 70 % etanol to ganger, oppløst i LoTE-buffer (10 mM TRIS). hydroklorid, 1 mM EDTA-buffer, pH 8), og lagret ved -80°C.

RNA-ekstraksjon: Ferskt vev vil bli lagret i RNAlater for ekstraksjon av RNA og lagret i -80°C.

Genomisk analyse: Bruk av neste generasjons sekvenseringsanalyse for kopiantallsavvik og enkeltnukleotidvariasjoner for å analysere prøvene samlet ved bruk av massiv parallellsekvensering av hagle som tidligere beskrevet. Vi vil også bruke sekvensering for å analysere mikrobiotaen til kohorten. Bakteriell 16S rRNA-gensekvensering: En aliquot av DNA vil bli brukt til å screene oralt mikrobielt samfunn ved å bruke 16S rRNA-genet V3-V4-regionen amplikonsekvensering 24. QIIME2 med den nyeste Silva ribosomale RNA-databasen vil bli brukt til å klassifisere amplikonsekvensvarianter, med operativ taksonomisk tabell som viser andelen bakterieavlesninger per prøve. Mycobiota ITS-gensekvensering: vi vil målrette mycobiota internt transkribert spacer-gen (ITS) for å karakterisere oral soppsamfunn. En kort region av ITS1 (~270 bp) vil bli PCR-amplifisert og sekvensert ved bruk av MiSeq. Lesene vil bli behandlet mot en UNITE-soppdatabase, og klassifikasjonstabellene vil bli generert på arts-, slekts- og OTU-nivå for statistiske analyser.

Ekspresjonsanalyse: Etterforskerne vil avgjøre om disse genomisk endrede svulstene uttrykker spesifikke endringer i signalproteiner ved bruk av immunhistokjemisk farging (IHC) og proteinprofilering ved hjelp av proteinmatriser. FFPE-seksjoner eller frosset vev vil bli høstet for sammen med genomisk karakteriseringsstudie for IHC-analyser, eller proteinprofilering. For IHC-analyse eller proteinprofilering vil totalt 5 FFPE-slides bli brukt for IHC eller proteinekstraksjon for proteinprofilering som tidligere publisert. RNA vil bli ekstrahert og underkastet RNA-analyser, inkludert RNA-seq, ekspresjonsarray og RT-PCR-analyser for å bestemme spesifikke genekspresjonsmønstre for øsofagustumorer, samt ekspresjon av potensielle biomarkører.

Bakteriekultur: For ytterligere å forstå rollen til mikrobiomet som en biomarkør i OESCC-vevsprøver vil det bli dyrket for bakterier identifisert i sekvensering for å bli betydelig beriket i svulster. Vevsprøver ble aseptisk maserert med engangsskalpeller og vortexet i 30 sekunder i PBS (500 l), og de rene suspensjonene ble brukt til å lage 10 ganger 2 ) fortynninger. Pene suspensjoner (50 l) ble spredt hver på blodagar (BA), kresen anaerob agar (FAA) (BA og FAA supplert med 5 % defibrinert saueblod; TCS Biosciences Ltd.), og Sabourauds agar (Lab MTM; International Diagnostics Group plc). Fortynningene og de siste PBS-vaskene av prøvene (se ovenfor) ble spredt på BA og FAA. BA og Sabourauds agarplater ble inkubert aerobt ved 37°C i 48 timer. FAA-plater ble inkubert i et anaerobt skap ved 36 °C i 96 timer.

Resultatmål

1. Lokoregional residivfri overlevelse vil bli registrert fra diagnosetidspunkt til residivtidspunkt lokalt, regionalt eller lokalt og regionalt.
2. Sykdomsspesifikk overlevelse vil bli registrert fra tidspunktet for diagnose til tidspunktet for død fra OESCC.
3. Samlet overlevelse vil bli registrert fra diagnosetidspunkt til dødstidspunkt av alle årsaker.

Statistisk analyse Assosiasjon mellom mikrober, kirurgisk behandling og individers metadata (f.eks. kjønn, alder, røyking, drikking, T/N-stadier, overlevelse, residiv) vil bli analysert ved å bruke en blanding av ordinasjon, ikke-parametrisk multivariat variansanalyse, matrikskorrelasjon, kjikvadrattest, generalisert lineær modell eller betinget logistisk regresjonsmodell. Ytelsen til de endelige biomarkørene vil bli vurdert ved kryssvalidering og oppsummert med c-indeksscore for å vurdere samsvaret mellom modell- og sammenligningsgrupper ved bruk av ROC-kurver. Alle multiple testkorrigeringer vil bli utført ved å beregne FDR-er ved å bruke BenjaminiHochenberg-metoden, og justerte p-verdier < 0,05 vil bli ansett som statistisk signifikante.