Mikrobiomet av esofageal skivepitelcancer

Matstrupscancer bidrar väsentligt till den globala cancerbördan som den sjätte vanligaste orsaken till global cancerrelaterad död. Esofageal skivepitelcancer (OESCC) är en av de vanligaste typerna av övre gastrointestinala (UGI) karcinom i vissa regioner globalt, särskilt Kina och Japan i Asien. Sjukdomen har en extremt dålig prognos, med en total 5-års överlevnad på mindre än 30 %, främst på grund av sent stadium vid diagnos och hög sannolikhet för fjärrmetastaser. Även om OESCC är förknippat med riskfaktorer inklusive rökning och alkohol, är etiologin för OESCC fortfarande dåligt förstådd.

Allt fler bevis tyder på en nyckelroll för bakteriell mikrobiota i cancerframkallande. Nya data implicerar den mänskliga mikrobiomet i en mängd olika cancerformer, framför allt Fusobacterium i kolorektal cancer och Helicobacter i magcancer. Konsortiet av bakteriell mikrobiom som koloniserar mag-tarmkanalen är omfattande och interagerar på ett komplext sätt. Mikrobiomet kan interagera med genetiska och miljömässiga faktorer för att metabolisera kostbeståndsdelar och xenobiotika, bland andra funktioner. När den mikrobiella balansen störs kan mikrobiotan förändra värdcellsproliferation och död, manipulera immunsystemet och påverka värdmetabolismen, vilket ger upphov till karcinom. Flera studier har rapporterat en viktig roll för den mänskliga mikrobiotan i övre gastrointestinala karcinom och funnit samband mellan mikrobiotan och vissa sjukdomar i UGI-kanalen, såsom esofagit och Barrett-esofagus, och med skivepiteldysplasi och skivepitelcancer i matstrupen. En annan ännu mindre välkänd är svampmikrobiomets roll i OESCC.

Här kommer utredarna att försöka utvärdera bakterie- och svampmikrobiomets roll i OESCC och värdmikroberinteraktionerna som kan spela en roll i förståelsen och hanteringen av OESCC.

Studiefrågor:

1. Skiljer sig mikrobiomet mellan OESCC och normala patienter?
2. Ändrar mikrobiomet från normalt genom premalignitet till malignitet?
3. Vilka mekanismer är involverade i mikrobiomet och utvecklingen eller progressionen av OESCC?

Studera design:

Detta är en prospektiv studie. Studien kommer att genomföras i enlighet med Helsingforsdeklarationen.

Patienter skulle rekryteras från Prince of Wales Hospital från juni 2020 till maj 2025. 100 patienter med nydiagnostiserad OESCC eller esofageal squamous dysplasi kommer att rekryteras till testgruppen. 100 patienter som genomgår en esofagogastroduodenoskopi (OGD) utan malignitet i anamnesen kommer att rekryteras till kontrollgruppen. Den förväntade varaktigheten för ämnesdeltagande är mindre än två månader.

Studien har två besök, enligt följande:

1. Besök 1:

   i. Att diskutera om projektet och att underteckna formuläret för informerat samtycke; ii. För att samla munsköljning 20ml; iii. För att fylla i frågeformuläret: Gut Microbe - Medicinsk och hälsofrågeformulär.

2. Besök 2:

Att ha OGD. Besök 2 kommer att utföras inom två månader efter besök 1 och måste före behandling.

i. Testgrupp: Med undersökning av lesionen med biopsi av tumör, biopsi av intilliggande normal vävnad, spola med normal koksaltlösning.

ii. Kontrollgrupp: Kommer att ta en biopsi av normal vävnad och spola med normal koksaltlösning.

Motivering för provstorlek:

Detta är en prospektiv studie utan tidigare data baserad på OESCC. Men baserat på data från skivepitelcancer i huvud och nacke (HNSCC) med viss överlappning av traditionella riskfaktorer siktar forskarna på att rekrytera minst 100 OESCC-patienter och 100 friska försökspersoner. I HNSCC-studie med 54 HNSCC-tumörvävnader och angränsande normala vävnader har det genererat 16S rRNA-kortläsningar som kan skilja fall från kontroller. Totalt 77 bakteriesläkten med >0,1% genomsnittlig relativ förekomst observerades i tumörvävnader. En sällsynthetsanalys visade att minst 73 släkten kan detekteras från vilket som helst av 35 prover, vilket tyder på att rekrytering av 100 patienter och 100 kontroller uppfyller den minimerade provstorleken för att innehålla nästan hela spektrumet av orala bakterier och förväntas ha en styrka på 0,8 och konfidensnivå på 95 % för att karakterisera oral mikrobiota dysbios mellan fall och kontroller.

Oberoende variabler

Följande oberoende variabler kommer att undersökas för att utvärdera sambandet mellan metyleringspanelen och OESCC:

1. Kliniska faktorer: TNM stadieindelning av sjukdom, komorbiditeter;
2. Cancerriskfaktorer: rökhistoria, alkoholkonsumtion;
3. Patientfaktorer: kön, ålder;
4. Histologiska egenskaper: tumördjup, extrakapsulär spridning, lymfvaskulär invasion, perineural invasion.

Exempel:

Munsköljning: Före proceduren skulle en munsköljning utföras genom att be alla patienter att skölja munhålan med 20 ml normal koksaltlösning. Den resulterande lösningen skulle behållas för efterföljande analys.

Endoskopiska ingrepp Endoskopiska ingrepp skulle utföras av läkare med expertis för att utföra övre endoskopi. Det skulle genomföras vid Combined Endoscopy Center, Prince of Wales Hospital. Topikal lokalbedövning kommer att appliceras på orofarynx. Endoskop med förstoring/dubbelfokus och NBI-funktion skulle användas. En mjuk svart huva skulle fästas på spetsen av endoskopet för bättre justering av brännvidden.

Patienter i testgruppen skulle sedan genomgå endoskopi med en biopsi av tumören och en biopsi av den intilliggande normala matstrupsslemhinnan. Dessutom skulle esofagussköljning också utföras genom att försiktigt spola matstrupen med 20 ml normal koksaltlösning och vätskan sugs upp och samlas upp för analys.

Patienter i kontrollgruppen skulle genomgå endoskopi enligt vanlig klinisk praxis. En biopsi skulle tas från normal esofagusslemhinna för analys. På liknande sätt skulle esofagussköljning utföras.

Experiment DNA-extraktion och bisulfitmodifiering: DNA från mikrodissekerade färska vävnader och saliv kommer att extraheras med fenol-kloroform, fällas ut i 100 % etanol, centrifugeras vid 5100 rpm i 45 minuter, tvättas i 70 % etanol två gånger, lösas i LoTE-buffert (10 mM TRIS). hydroklorid, 1 mM EDTA-buffert, pH 8) och lagrades vid -80°C.

RNA-extraktion: Färsk vävnad kommer att lagras i RNAlater för extraktion av RNA och lagras i -80°C.

Genomisk analys: Använda nästa generations sekvenseringsanalys för kopieantalsaberrationer och enstaka nukleotidvariationer för att analysera proverna som samlats in med massiv parallell sekvensering med hagelgevär som tidigare beskrivits. Vi kommer också att använda sekvensering för att analysera kohortens mikrobiota. Bakteriell 16S rRNA-gensekvensering: En alikvot av DNA kommer att användas för att screena oral mikrobiell gemenskap med hjälp av 16S rRNA-genen V3-V4-regionens amplikonsekvensering 24. QIIME2 med den senaste Silva ribosomala RNA-databasen kommer att användas för att klassificera amplikonsekvensvarianter, med operativ taxonomisk tabell som visar andelen bakterieavläsningar per prov. Mycobiota ITS-gensekvensering: vi kommer att rikta in mycobiota intern transkriberad spacer-gen (ITS) för att karakterisera oral svampgemenskap. En kort region av ITS1 (~270 bp) kommer att PCR-amplifieras och sekvenseras med MiSeq. Läsningarna kommer att behandlas mot en svamp UNITE-databas och klassificeringstabellerna kommer att genereras på art-, släkt- och OTU-nivå för statistiska analyser.

Uttrycksanalys: Utredarna kommer att avgöra om dessa genomiskt förändrade tumörer uttrycker specifika förändringar i signalproteiner med hjälp av immunhistokemisk färgning (IHC) och proteinprofilering av proteinmatriser. FFPE-sektioner eller frusna vävnader kommer att skördas för tillsammans med genomisk karakteriseringsstudie för IHC-analyser eller proteinprofilering. För IHC-analys eller proteinprofilering kommer totalt 5 FFPE-objektglas att användas för IHC eller proteinextraktion för proteinprofilering som tidigare publicerats. RNA kommer att extraheras och utsättas för RNA-analyser, inklusive RNA-seq, expression array och RT-PCR-analyser för att fastställa specifika genuttrycksmönster för esofageala tumörer, såväl som uttryck av potentiella biomarkörer.

Bakteriekultur: För att ytterligare förstå mikrobiomets roll som en biomarkör i OESCC-vävnadsprover kommer att odlas för att bakterier som identifierats i sekvensering avsevärt berikas i tumörer. Vävnadsprover macererades aseptiskt med engångsskalpeller och virvlades i 30 sekunder i PBS (500 l), och de rena suspensionerna användes för att göra 10-faldiga 2 ) spädningar. Prydliga suspensioner (50 l) spreds på vardera blodagar (BA), kräsen anaerob agar (FAA) (BA och FAA kompletterad med 5 % defibrinerat fårblod; TCS Biosciences Ltd.) och Sabourauds agar (Lab MTM; International Diagnostics Group plc). Spädningarna och slutliga PBS-tvättarna av proverna (se ovan) spreds ut på BA och FAA. BA och Sabourauds agarplattor inkuberades aerobt vid 37°C under 48 timmar. FAA-plattor inkuberades i ett anaerobt skåp vid 36°C under 96 timmar.

Resultatmått

1. Lokoregional återfallsfri överlevnad kommer att registreras från tidpunkten för diagnos till tidpunkten för återfall lokalt, regionalt eller lokalt och regionalt.
2. Sjukdomsspecifik överlevnad kommer att registreras från tidpunkten för diagnos till tidpunkten för död från OESCC.
3. Den totala överlevnaden kommer att registreras från tidpunkten för diagnos till tidpunkten för döden av alla orsaker.

Statistisk analys Samband mellan mikrober, kirurgisk behandling och individers metadata (t.ex. kön, ålder, rökning, drickande, T/N-stadier, överlevnad, återfall) kommer att analyseras med en blandning av ordination, icke-parametrisk multivariat variansanalys, matriskorrelation, chi-kvadrattest, generaliserad linjär modell eller villkorad logistisk regressionsmodell. Prestandan för de slutliga biomarkörerna kommer att bedömas genom korsvalidering och sammanfattas med c-indexpoäng för att bedöma överensstämmelsen mellan modell- och jämförelsegrupper med hjälp av ROC-kurvor. Alla multipla testkorrigeringar kommer att utföras genom att beräkna FDR med BenjaminiHochenberg-metoden, och justerade p-värden < 0,05 kommer att betraktas som statistiskt signifikanta.