Mikrobiom spinocelulárního karcinomu jícnu

Karcinom jícnu významně přispívá k celosvětovému hodnocení nádorové zátěže jako šesté hlavní příčiny úmrtí souvisejících s rakovinou. Spinocelulární karcinom jícnu (OESCC) je jedním z nejběžnějších typů karcinomu horního gastrointestinálního traktu (UGI) v některých oblastech světa, zejména v Číně a Japonsku v Asii. Onemocnění má extrémně špatnou prognózu s celkovým 5letým přežitím méně než 30 %, hlavně kvůli pozdnímu stádiu diagnózy a vysoké pravděpodobnosti vzdálených metastáz. Přestože je OESCC spojena s rizikovými faktory včetně kouření a alkoholu, etiologie OESCC je stále špatně pochopena.

Stále více důkazů ukazuje na klíčovou roli bakteriální mikrobioty v karcinogenezi. Nové údaje naznačují, že lidský mikrobiom je zapojen do různých druhů rakoviny, zejména Fusobacterium u kolorektálního karcinomu a Helicobacter u rakoviny žaludku. Konsorcium bakteriálního mikrobiomu kolonizujícího gastrointestinální trakt je rozsáhlé a interaguje komplexním způsobem. Mikrobiom může interagovat s genetickými a environmentálními faktory, aby kromě jiných funkcí metabolizoval složky potravy a xenobiotika. Když je mikrobiální rovnováha narušena, mikrobiota by mohla změnit proliferaci a smrt hostitelské buňky, manipulovat s imunitním systémem a ovlivnit metabolismus hostitele, což by mohlo vést ke vzniku karcinomu. Několik studií uvádí důležitou roli lidské mikroflóry u karcinomu horní části gastrointestinálního traktu a zjistilo souvislosti mezi mikrobiotou a některými onemocněními UGI traktu, jako je ezofagitida a Barrettův jícen, a s dlaždicovou dysplazií a dlaždicovým karcinomem jícnu. Další ještě méně známá je role houbového mikrobiomu v OESCC.

Zde se výzkumníci budou snažit vyhodnotit roli bakteriálního a plísňového mikrobiomu v OESCC a interakcích hostitelských mikrobů, které mohou hrát roli v porozumění a řízení OESCC.

Studijní otázky:

1. Liší se mikrobiom mezi OESCC a normálními pacienty?
2. Mění se mikrobiom z normálního přes premalignitu na malignitu?
3. Jaké jsou mechanismy zapojené do mikrobiomu a vývoje nebo progrese OESCC?

Studovat design:

Toto je prospektivní studie. Studie bude provedena v souladu s Helsinskou deklarací.

Pacienti by byli přijímáni z nemocnice Prince of Wales Hospital od června 2020 do května 2025. Do testovací skupiny bude přijato 100 pacientů s nově diagnostikovaným OESCC nebo skvamózní dysplazií jícnu. Do kontrolní skupiny bude přijato 100 pacientů podstupujících esofagogastroduodenoscopy (OGD) bez anamnézy malignity. Předpokládaná délka účasti na předmětu je kratší než dva měsíce.

Studie má dvě návštěvy, a to takto:

1. Návštěva 1:

   i. Diskutovat o projektu a podepsat informovaný souhlas; ii. Pro odběr ústní vody 20 ml; iii. Pro vyplnění dotazníku: Střevní mikrob – lékařský a zdravotní dotazník.

2. Návštěva 2:

Mít OGD. Návštěva 2 bude provedena do dvou měsíců po návštěvě 1 a musí před léčbou.

i. Testovaná skupina: S vyšetřením léze s biopsií tumoru, biopsií přilehlé normální tkáně, propláchnutí normálním fyziologickým roztokem.

ii. Kontrolní skupina: Bude provedena biopsie normální tkáně a propláchnuta normálním fyziologickým roztokem.

Zdůvodnění velikosti vzorku:

Toto je prospektivní studie bez předchozích údajů na základě OESCC. Ale na základě údajů ze spinocelulárního karcinomu hlavy a krku (HNSCC) s určitým překrýváním v tradičních rizikových faktorech se výzkumníci zaměřují na nábor alespoň 100 pacientů s OESCC a 100 zdravých subjektů. Ve studii HNSCC s použitím 54 nádorových tkání HNSCC a přilehlých normálních tkání generovala krátká čtení 16S rRNA schopná rozlišit případy od kontrol. V nádorových tkáních bylo pozorováno celkem 77 bakteriálních rodů s průměrnou relativní četností > 0,1 %. Analýza vzácnosti ukázala, že z kteréhokoli z 35 vzorků lze detekovat alespoň 73 rodů, což naznačuje, že nábor 100 pacientů a 100 kontrol splňuje minimální velikost vzorku, aby obsahoval téměř celé spektrum orálních bakterií, a očekává se, že bude mít sílu 0,8 a úroveň spolehlivosti 95 % pro charakterizaci orální mikrobioty dysbiózy mezi případy a kontrolami.

Nezávislé proměnné

Následující nezávislé proměnné budou zkoumány za účelem vyhodnocení asociace methylačního panelu a OESCC:

1. Klinické faktory: TNM staging onemocnění, komorbidity;
2. Rizikové faktory rakoviny: kouření v anamnéze, konzumace alkoholu;
3. Faktory pacienta: pohlaví, věk;
4. Histologická charakteristika: hloubka tumoru, extrakapsulární šíření, lymfovaskulární invaze, perineurální invaze.

Vzorky:

Ústní výplach: Před zákrokem se provede ústní výplach tak, že všichni pacienti budou požádáni, aby vypláchli ústní dutinu 20 ml normálního fyziologického roztoku. Výsledný roztok by byl uchován pro následnou analýzu.

Endoskopické výkony Endoskopické výkony by prováděli lékaři s odborností pro provádění horní endoskopie. Bylo by to provedeno v kombinovaném endoskopickém centru, Prince of Wales Hospital. Do orofaryngu bude aplikováno lokální lokální anestetikum. Byly by použity endoskopy se zvětšením / duálním ohniskem a funkcí NBI. Ke špičce endoskopu by byla připojena měkká černá kapuce pro lepší nastavení ohniskové vzdálenosti.

Pacienti v testované skupině by pak podstoupili endoskopii s jednou biopsií nádoru a jednou biopsií přilehlé normální sliznice jícnu. Kromě toho se také provede výplach jícnu jemným propláchnutím jícnu 20 ml normálního fyziologického roztoku a tekutina se odsaje a odebere pro analýzu.

Pacienti v kontrolní skupině by podstoupili endoskopii podle obvyklé klinické praxe. Jedna biopsie by byla odebrána z normální sliznice jícnu pro analýzu. Podobně by se provedl výplach jícnu.

Experimenty Extrakce DNA a bisulfitová modifikace: DNA z mikrodisekovaných čerstvých tkání a slin bude extrahována fenol-chloroformem, precipitována ve 100% ethanolu, centrifugována při 5100 otáčkách za minutu po dobu 45 minut, dvakrát promyta v 70% ethanolu, rozpuštěna v LoTE pufru (10mM TRIS hydrochlorid, 1 mM EDTA pufr, pH 8) a skladovány při -80 °C.

Extrakce RNA: Čerstvá tkáň bude uložena v RNAlater pro extrakci RNA a uložena při -80°C.

Genomická analýza: Využití sekvenační analýzy nové generace pro aberace počtu kopií a variace jednoho nukleotidu k analýze vzorků odebraných pomocí masivního paralelního sekvenování pomocí brokovnice, jak bylo popsáno dříve. Použijeme také sekvenování k analýze mikrobioty kohorty. Sekvenování bakteriálního genu 16S rRNA: Alikvotní část DNA bude použita ke screeningu orální mikrobiální komunity pomocí sekvenování amplikonu oblasti V3-V4 genu 16S rRNA 24. QIIME2 s nejnovější Silva ribozomální RNA databází bude použito ke klasifikaci varianty amplikonové sekvence, přičemž operační taxonomická tabulka ukazuje podíl bakteriálních čtení na vzorek. Sekvenování genu Mycobiota ITS: zaměříme se na interní transkribovaný spacer gen (ITS) mykobioty, abychom charakterizovali komunitu orálních hub. Krátká oblast ITS1 (~270 bp) bude amplifikována PCR a sekvenována pomocí MiSeq. Odečty budou zpracovány proti fungální databázi UNITE a klasifikační tabulky budou generovány na úrovni druhů, rodů a OTU pro statistické analýzy.

Analýza exprese: Výzkumníci určí, zda tyto genomicky změněné nádory exprimují specifické změny v signálních proteinech pomocí imunohistochemického barvení (IHC) a profilování proteinů pomocí proteinových čipů. Řezy FFPE nebo zmrazené tkáně budou odebrány společně se studií genomové charakterizace pro IHC analýzy nebo profilování proteinů. Pro IHC analýzu nebo profilování proteinů bude použito celkem 5 FFPE sklíček pro IHC nebo extrakci proteinů pro profilování proteinů, jak bylo dříve publikováno. RNA bude extrahována a podrobena analýzám RNA, včetně analýz RNA-seq, expresního pole a RT-PCR, aby se určily specifické vzorce genové exprese nádorů jícnu, stejně jako exprese potenciálních biomarkerů.

Bakteriální kultura: Pro další pochopení úlohy mikrobiomu jako biomarkeru v OESCC tkáňových vzorcích budou kultivovány bakterie identifikované při sekvenování, které mají být významně obohaceny o nádory. Tkáňové vzorky byly asepticky macerovány skalpely na jedno použití a vortexovány po dobu 30 sekund v PBS (500 ul) a čisté suspenze byly použity k vytvoření 10násobných 2 ředění. Čisté suspenze (50 l) byly naneseny na krevní agar (BA), náročný anaerobní agar (FAA) (BA a FAA doplněný 5 % defibrinované ovčí krve; TCS Biosciences Ltd.) a Sabouraudův agar (Lab MTM; International Diagnostics Group plc). Ředění a konečné promytí vzorků PBS (viz výše) byly rozetřeny na BA a FAA. BA a Sabouraudovy agarové plotny byly inkubovány aerobně při 37 °C po dobu 48 hodin. Destičky FAA byly inkubovány v anaerobní komoře při 36 °C po dobu 96 hodin.

Měření výsledků

1. Lokoregionální přežití bez recidivy bude zaznamenáváno od okamžiku diagnózy do doby recidivy lokálně, regionálně nebo lokálně a regionálně.
2. Přežití specifické pro onemocnění bude zaznamenáváno od okamžiku diagnózy do okamžiku úmrtí na OESCC.
3. Celkové přežití bude zaznamenáváno od okamžiku diagnózy do okamžiku úmrtí ze všech příčin.

Statistická analýza Asociace mezi mikroby, chirurgickým zákrokem a metadaty jednotlivců (např. pohlaví, věk, kouření, pití, stadia T/N, přežití, recidiva) bude analyzována pomocí kombinace ordinace, neparametrické multivariační analýzy rozptylu, maticová korelace, chí-kvadrát test, zobecněný lineární model nebo podmíněné logistické regresní modely. Výkon finálních biomarkerů bude hodnocen křížovou validací a shrnut pomocí c-index skóre pro posouzení shody mezi modelovými a srovnávacími skupinami pomocí ROC křivek. Všechny korekce vícenásobného testování budou provedeny výpočtem FDR pomocí BenjaminiHochenbergovy metody a upravené hodnoty p < 0,05 budou považovány za statisticky významné.