Le microbiome du carcinome épidermoïde de l'œsophage

Le carcinome de l'œsophage contribue de manière significative au fardeau mondial du cancer en se classant au sixième rang des causes de décès liés au cancer dans le monde. Le carcinome épidermoïde de l'œsophage (OESCC) est l'un des types les plus courants de carcinome gastro-intestinal supérieur (UGI) dans certaines régions du monde, en particulier la Chine et le Japon en Asie. La maladie a un pronostic extrêmement sombre, avec des taux de survie globaux à 5 ans inférieurs à 30 %, principalement en raison du stade tardif au moment du diagnostic et de la forte probabilité de métastases à distance. Bien que l'OESCC soit associé à des facteurs de risque, notamment le tabagisme et l'alcool, l'étiologie de l'OESCC est encore mal comprise.

De plus en plus de preuves indiquent un rôle clé du microbiote bactérien dans la carcinogenèse. De nouvelles données impliquent le microbiome humain dans une variété de cancers, notamment Fusobacterium dans le cancer colorectal et Helicobacter dans le cancer gastrique. Le consortium du microbiome bactérien colonisant le tractus gastro-intestinal est vaste et interagit de manière complexe. Le microbiome peut interagir avec des facteurs génétiques et environnementaux pour métaboliser les constituants alimentaires et les xénobiotiques, entre autres fonctions. Lorsque l'équilibre microbien est perturbé, le microbiote pourrait altérer la prolifération et la mort des cellules hôtes, manipuler le système immunitaire et influencer le métabolisme de l'hôte, donnant lieu à un carcinome. Plusieurs études ont rapporté un rôle important du microbiote humain dans le carcinome gastro-intestinal supérieur et trouvé des associations entre le microbiote et certaines maladies du tractus UGI, telles que l'œsophagite et l'œsophage de Barrett, et avec la dysplasie squameuse et le carcinome squameux de l'œsophage. Un autre encore moins connu est le rôle du microbiome fongique dans l'OESCC.

Ici, les chercheurs chercheront à évaluer le rôle du microbiome bactérien et fongique dans l'OESCC et les interactions microbes hôtes qui peuvent jouer un rôle dans la compréhension et la gestion de l'OESCC.

Questions d'étude :

1. Le microbiome diffère-t-il entre l'OESCC et les patients normaux ?
2. Le microbiome passe-t-il de la normale à la prémalignité puis à la malignité ?
3. Quels sont les mécanismes impliqués dans le microbiome et le développement ou la progression de l'OESCC ?

Étudier le design:

Il s'agit d'une étude prospective. L'étude sera menée conformément à la Déclaration d'Helsinki.

Les patients seraient recrutés à l'hôpital Prince of Wales de juin 2020 à mai 2025. 100 patients atteints d'OESCC nouvellement diagnostiqué ou de dysplasie squameuse œsophagienne seront recrutés dans le groupe de test. 100 patients subissant une œsophagogastroduodénoscopie (OGD) sans antécédent de malignité seront recrutés dans le groupe témoin. La durée prévue de la participation des sujets est inférieure à deux mois.

L'étude comporte deux visites, comme suit :

1. Visite 1 :

   je. Discuter du projet et signer le formulaire de consentement éclairé ; ii. Pour recueillir rince-bouche 20ml; iii. Pour remplir le questionnaire : Gut Microbe - Questionnaire médical et de santé.

2. Visite 2 :

Avoir OGD. La visite 2 sera effectuée dans les deux mois suivant la visite 1 et doit être effectuée avant le traitement.

je. Groupe test : avec examen de la lésion avec biopsie de la tumeur, biopsie du tissu normal adjacent, rinçage avec une solution saline normale.

ii. Groupe témoin : Aura une biopsie de tissu normal et un rinçage avec une solution saline normale.

Justification de la taille de l'échantillon :

Il s'agit d'une étude prospective sans données antérieures basées sur l'OESCC. Mais sur la base des données du carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) avec un certain chevauchement des facteurs de risque traditionnels, les chercheurs ciblent le recrutement d'au moins 100 patients OESCC et 100 sujets sains. Dans une étude HNSCC utilisant 54 tissus tumoraux HNSCC et les tissus normaux adjacents, des lectures courtes d'ARNr 16S capables de discriminer les cas des témoins ont été générées. Un total de 77 genres bactériens avec une abondance relative moyenne > 0,1 % a été observé dans les tissus tumoraux. Une analyse de raréfaction a indiqué qu'au moins 73 genres peuvent être détectés à partir de l'un des 35 échantillons, ce qui suggère que le recrutement de 100 patients et 100 témoins respecte la taille d'échantillon minimisée pour contenir un spectre presque complet de bactéries buccales et devrait avoir une puissance de 0,8 et niveau de confiance de 95 % pour caractériser la dysbiose du microbiote oral entre les cas et les témoins.

Variables indépendantes

Les variables indépendantes suivantes seront examinées pour évaluer l'association du panel de méthylation et de l'OESCC :

1. Facteurs cliniques : stade TNM de la maladie, comorbidités ;
2. Facteurs de risque de cancer : antécédents de tabagisme, consommation d'alcool ;
3. Facteurs liés au patient : sexe, âge ;
4. Caractéristiques histologiques : profondeur tumorale, extension extracapsulaire, envahissement lymphovasculaire, envahissement périneural.

Échantillons :

Rinçage buccal : Avant la procédure, un rinçage buccal serait effectué en demandant à tous les patients de rincer la cavité buccale avec 20 ml de solution saline normale. La solution résultante serait conservée pour une analyse ultérieure.

Procédures endoscopiques Les procédures endoscopiques seraient effectuées par des médecins ayant une expertise dans la réalisation d'endoscopies hautes. Elle se déroulerait au Combined Endoscopy Center, Prince of Wales Hospital. Un anesthésique local topique sera appliqué sur l'oropharynx. Des endoscopes avec grossissement/double foyer et fonction NBI seraient utilisés. Un capuchon noir doux serait attaché à la pointe de l'endoscope pour un meilleur réglage de la distance focale.

Les patients du groupe test subiraient ensuite une endoscopie avec une biopsie de la tumeur et une biopsie de la muqueuse œsophagienne normale adjacente. De plus, un rinçage œsophagien serait également effectué en rinçant doucement l'œsophage avec 20 ml de solution saline normale et le liquide aspiré et collecté pour analyse.

Les patients du groupe témoin subiraient une endoscopie conformément à la pratique clinique habituelle. Une biopsie serait prélevée sur la muqueuse œsophagienne normale pour analyse. De même, un rinçage œsophagien serait effectué.

Expériences Extraction d'ADN et modification au bisulfite : l'ADN des tissus frais microdisséqués et de la salive sera extrait au phénol-chloroforme, précipité dans de l'éthanol à 100 %, centrifugé à 5 100 tpm pendant 45 minutes, lavé deux fois dans de l'éthanol à 70 %, dissous dans du tampon LoTE (10 mM TRIS chlorhydrate, tampon EDTA 1 mM, pH 8) et conservé à -80°C.

Extraction d'ARN : les tissus frais seront stockés dans RNAlater pour l'extraction de l'ARN et stockés à -80 °C.

Analyse génomique : Utilisation de l'analyse de séquençage de nouvelle génération pour les aberrations du nombre de copies et les variations d'un seul nucléotide pour analyser les échantillons collectés à l'aide d'un séquençage parallèle massif comme décrit précédemment. Nous utiliserons également le séquençage pour analyser le microbiote de la cohorte. Séquençage du gène de l'ARNr 16S bactérien : une aliquote d'ADN sera utilisée pour cribler la communauté microbienne orale à l'aide du séquençage de l'amplicon de la région V3-V4 du gène de l'ARNr 16S 24. QIIME2 avec la dernière base de données d'ARN ribosomal Silva sera utilisé pour classer les variants de séquence d'amplicon, avec un tableau taxonomique opérationnel montrant la proportion de lectures bactériennes par échantillon. Séquençage du gène ITS du mycobiote : nous ciblerons le gène espaceur interne transcrit (ITS) du mycobiote pour caractériser la communauté fongique buccale. Une courte région de ITS1 (~270 bp) sera amplifiée par PCR et séquencée à l'aide de MiSeq. Les lectures seront traitées par rapport à une base de données fongique UNITE, et les tableaux de classification seront générés au niveau des espèces, des genres et des OTU pour des analyses statistiques.

Analyse de l'expression : les chercheurs détermineront si ces tumeurs génomiquement modifiées expriment des changements spécifiques dans les protéines de signalisation en utilisant la coloration immunohistochimique (IHC) et le profilage des protéines par des puces à protéines. Des coupes FFPE ou des tissus congelés seront récoltés parallèlement à une étude de caractérisation génomique pour les analyses IHC ou le profilage des protéines. Pour l'analyse IHC ou le profilage des protéines, un total de 5 lames FFPE seront utilisées pour l'IHC ou l'extraction des protéines pour le profilage des protéines, comme précédemment publié. L'ARN sera extrait et soumis à des analyses d'ARN, y compris des analyses RNA-seq, expression array et RT-PCR afin de déterminer les modèles d'expression génique spécifiques des tumeurs de l'œsophage, ainsi que l'expression de biomarqueurs potentiels.

Culture bactérienne : Pour mieux comprendre le rôle du microbiome en tant que biomarqueur dans l'OESCC, des échantillons de tissus seront cultivés pour que les bactéries identifiées lors du séquençage soient considérablement enrichies en tumeurs. Les échantillons de tissu ont été macérés aseptiquement avec des scalpels jetables et vortexés pendant 30 secondes dans du PBS (500 l), et les suspensions pures ont été utilisées pour faire des dilutions au 10ème. Des suspensions pures (50 l) ont chacune été étalées sur de la gélose au sang (BA), de la gélose anaérobie fastidieuse (FAA) (BA et FAA additionnées de 5 % de sang de mouton défibriné ; TCS Biosciences Ltd.) et de la gélose de Sabouraud (Lab MTM ; International Diagnostics Group plc). Les dilutions et les lavages finaux au PBS des échantillons (voir ci-dessus) ont été étalés sur BA et FAA. Les plaques de gélose BA et Sabouraud ont été incubées en aérobiose à 37°C pendant 48 h. Les plaques FAA ont été incubées dans une enceinte anaérobie à 36 ° C pendant 96 h.

Mesures des résultats

1. La survie sans récidive loco-régionale sera enregistrée du moment du diagnostic au moment de la récidive au niveau local, régional ou local et régional.
2. La survie spécifique à la maladie sera enregistrée depuis le moment du diagnostic jusqu'au moment du décès de l'OESCC.
3. La survie globale sera enregistrée depuis le moment du diagnostic jusqu'au moment du décès, toutes causes confondues.

Analyse statistique L'association entre les microbes, le traitement chirurgical et les métadonnées des individus (par exemple, sexe, âge, tabagisme, consommation d'alcool, stades T / N, survie, récidive) sera analysée à l'aide d'un mélange d'ordination, d'analyse multivariée non paramétrique corrélation matricielle, test du chi carré, modèle linéaire généralisé ou modèles de régression logistique conditionnelle. La performance des biomarqueurs finaux sera évaluée par validation croisée et résumée par le score c-index pour évaluer la concordance entre les groupes modèles et de comparaison à l'aide de courbes ROC. Toutes les corrections de tests multiples seront effectuées en calculant les FDR à l'aide de la méthode BenjaminiHochenberg, et les valeurs de p ajustées < 0,05 seront considérées comme statistiquement significatives.