A nyelőcső laphámsejtes karcinóma mikrobiomája

A nyelőcső karcinóma jelentősen hozzájárul ahhoz, hogy a globális rákos megbetegedések a hatodik helyen szerepelnek a rákkal összefüggő halálozások globális okai között. A nyelőcső laphámsejtes karcinóma (OESCC) a felső gasztrointesztinális (UGI) karcinóma egyik leggyakoribb típusa a világ egyes régióiban, különösen Kínában és Japánban Ázsiában. A betegség prognózisa rendkívül rossz, az összesített 5 éves túlélési arány kevesebb, mint 30%, főként a diagnózis késői stádiuma és a távoli metasztázisok nagy valószínűsége miatt. Bár az OESCC kockázati tényezőkkel, köztük a dohányzással és az alkohollal jár, az OESCC etiológiája még mindig kevéssé ismert.

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a bakteriális mikrobióta kulcsszerepet játszik a karcinogenezisben. Az újonnan megjelenő adatok az emberi mikrobiomot számos rákos megbetegedésben befolyásolják, leginkább a Fusobacteriumot a vastagbélrákban és a Helicobactert a gyomorrákban. A gasztrointesztinális traktusban kolonizáló bakteriális mikrobiomok konzorciuma kiterjedt és összetett módon kölcsönhatásba lép. A mikrobiom kölcsönhatásba léphet genetikai és környezeti tényezőkkel, hogy metabolizálja az étrendi összetevőket és a xenobiotikumokat, többek között más funkciókat is ellátva. Ha a mikrobiális egyensúly megbomlik, a mikrobiota megváltoztathatja a gazdasejt proliferációját és halálát, manipulálhatja az immunrendszert, és befolyásolhatja a gazdaszervezet anyagcseréjét, ami karcinómát okozhat. Számos tanulmány számolt be a humán mikrobiota fontos szerepéről a felső gasztrointesztinális karcinómában, és összefüggéseket talált a mikrobiota és az UGI traktus egyes betegségei között, mint például a nyelőcsőgyulladás és a Barrett-nyelőcső, valamint a nyelőcső laphámszpláziája és laphámrákja között. Egy másik, még kevésbé ismert a gomba mikrobióma szerepe az OESCC-ben.

Itt a kutatók arra törekednek, hogy értékeljék a bakteriális és gombás mikrobiom szerepét az OESCC-ben, valamint a gazdamikrobiális kölcsönhatásokat, amelyek szerepet játszhatnak az OESCC megértésében és kezelésében.

Tanulmányi kérdések:

1. Különbözik-e a mikrobiom az OESCC és a normál betegek között?
2. Változik-e a mikrobiom normálról a premalignitáson keresztül rosszindulatúvá?
3. Milyen mechanizmusok vesznek részt a mikrobiomban és az OESCC kialakulásában vagy progressziójában?

Dizájnt tanulni:

Ez egy prospektív tanulmány. A tanulmányt a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően hajtják végre.

A betegeket 2020 júniusától 2025 májusáig a Prince of Wales Kórházból veszik fel. 100 újonnan diagnosztizált OESCC-vel vagy nyelőcső laphámszpláziában szenvedő beteget vesznek fel a tesztcsoportba. 100 oesophagogastroduodenoscopián (OGD) átesett, rosszindulatú daganat kórtörténetében nem szereplő beteg kerül a kontrollcsoportba. A tantárgyi részvétel várható időtartama kevesebb, mint két hónap.

A tanulmány két látogatásból áll, az alábbiak szerint:

1. 1. látogatás:

   én. A projekt megvitatása és a beleegyező nyilatkozat aláírása; ii. Szájöblítő gyűjtéséhez 20ml; iii. A kérdőív kitöltéséhez: Gut Microbe – Orvosi és egészségügyi kérdőív.

2. 2. látogatás:

Hogy legyen OGD. A 2. látogatásra az 1. látogatást követő két hónapon belül kerül sor, és a kezelés előtt kötelező.

én. Vizsgálati csoport: A lézió vizsgálatával daganatbiopsziával, a szomszédos normál szövet biopsziájával, normál sóoldattal átöblítve.

ii. Kontroll csoport: Biopsziát vesznek a normál szövetből, és normál sóoldattal öblítik le.

A minta méretének indoklása:

Ez egy prospektív tanulmány, az OESCC-n alapuló korábbi adatok nélkül. A fej-nyaki laphámsejtes karcinóma (HNSCC) adatai alapján azonban a hagyományos kockázati tényezők némi átfedésével a kutatók legalább 100 OESCC-beteget és 100 egészséges alanyt kívánnak toborozni. A HNSCC vizsgálatban 54 HNSCC tumorszövet és a szomszédos normál szövetek felhasználásával 16S rRNS rövid leolvasást generált, amely képes megkülönböztetni az eseteket a kontrolloktól. A tumorszövetekben összesen 77 baktériumnemzetséget figyeltek meg, amelyek átlagos relatív abundanciája >0,1%. Egy ritkaságelemzés kimutatta, hogy a 35 minta bármelyikéből legalább 73 nemzetség kimutatható, ami arra utal, hogy a 100 betegből és 100 kontrollból álló toborzás megfelel a minimális mintanagyságnak, hogy a szájbaktériumok majdnem teljes spektrumát tartalmazza, és várhatóan 0,8 és 0,8 95%-os megbízhatósági szint az orális mikrobiota dysbiosis jellemzésére az esetek és a kontrollok között.

Független változók

A következő független változókat vizsgáljuk meg a metilációs panel és az OESCC kapcsolatának értékelésére:

1. Klinikai tényezők: a betegség TNM stádiuma, társbetegségek;
2. A rák kockázati tényezői: dohányzás, alkoholfogyasztás;
3. Betegtényezők: nem, életkor;
4. Szövettani jellemzők: daganat mélysége, extracapsularis terjedése, lymphovascularis invázió, perineurális invázió.

Minták:

Szájöblítés: Az eljárás előtt szájöblítést kell végezni, megkérve minden pácienst, hogy öblítse ki a szájüreget 20 ml normál sóoldattal. A kapott oldatot meg kell őrizni a későbbi elemzéshez.

Endoszkópos eljárások Az endoszkópos beavatkozásokat a felső endoszkópia elvégzésében jártas orvosok végeznék. A vizsgálatot a Prince of Wales Kórház Kombinált Endoszkópiai Központjában végeznék. Helyi helyi érzéstelenítést alkalmaznak az oropharynxon. Nagyítással/kettős fókusszal és NBI funkcióval rendelkező endoszkópokat használnának. Az endoszkóp hegyére puha fekete védőburkolatot kell rögzíteni a jobb gyújtótávolság beállításához.

A vizsgálati csoportba tartozó betegeket ezután endoszkópos vizsgálatnak vetik alá egy tumor biopsziával és egy biopsziával a szomszédos normál nyelőcső nyálkahártyájáról. Ezenkívül a nyelőcső öblítését úgy is végezzük, hogy a nyelőcsövet 20 ml normál sóoldattal óvatosan átöblítjük, majd a folyadékot leszívjuk és összegyűjtjük elemzés céljából.

A kontrollcsoportba tartozó betegeket a szokásos klinikai gyakorlatnak megfelelően endoszkópos vizsgálatnak vetik alá. Egy biopsziát vesznek a normál nyelőcső nyálkahártyájából elemzés céljából. Hasonlóképpen nyelőcsőöblítést is végeznek.

Kísérletek DNS extrakció és biszulfit módosítás: A mikropreparált friss szövetekből és nyálból származó DNS-t fenol-kloroformmal extraháljuk, 100%-os etanolban kicsapjuk, 5100 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 45 percig, kétszer mossuk 70%-os etanolban, feloldjuk LoTE TRIS pufferben (10 mM) hidroklorid, 1 mM EDTA puffer, pH 8), és -80 °C-on tároljuk.

RNS extrakció: A friss szövetet az RNAlaterben tároljuk az RNS extrakciójához, és -80 °C-on tároljuk.

Genomikai analízis: Következő generációs szekvenálási analízis felhasználása kópiaszám-rendellenességek és egyetlen nukleotid variáció esetén a korábban leírt sörétes masszív párhuzamos szekvenálás segítségével gyűjtött minták elemzéséhez. Szekvenálást is alkalmazunk a kohorsz mikrobiótájának elemzésére. Bakteriális 16S rRNS gén szekvenálás: A DNS egy alikvot részét a szájüregi mikrobiális közösség szűrésére használjuk a 16S rRNS gén V3-V4 régió amplikon szekvenálása 24 segítségével. A legújabb Silva riboszomális RNS adatbázissal rendelkező QIIME2-t az amplikon szekvencia variánsok osztályozására fogják használni, a működési taxonómiai táblázat pedig a bakteriális leolvasások mintánkénti arányát mutatja. Mycobiota ITS génszekvenálás: a mycobiota belső átírt távtartó génjét (ITS) célozzuk meg a szájgomba közösség jellemzésére. Az ITS1 egy rövid régióját (~270 bp) PCR-rel amplifikáljuk és MiSeq segítségével szekvenáljuk. A leolvasásokat egy gombás UNITE adatbázissal dolgozzuk fel, és az osztályozási táblázatokat faj-, nemzetség- és OTU-szinten generáljuk a statisztikai elemzésekhez.

Expressziós analízis: A kutatók immunhisztokémiai festéssel (IHC) és fehérjetömbökkel végzett fehérjeprofilozással határozzák meg, hogy ezek a genomiálisan megváltozott daganatok kifejeznek-e specifikus változásokat a jelátviteli fehérjékben. Az FFPE-metszeteket vagy a fagyasztott szöveteket az IHC-elemzésekhez vagy a fehérjeprofil-készítéshez szükséges genomikai jellemzési vizsgálatokkal együtt gyűjtik be. Az IHC analízishez vagy a fehérjeprofil-készítéshez összesen 5 FFPE-lemezt használnak fel IHC-hez vagy fehérje extrakcióhoz a fehérjeprofil készítéséhez, a korábban közzétett módon. Az RNS-t kivonják és RNS-elemzésnek vetik alá, beleértve az RNS-seq-et, az expressziós tömb- és az RT-PCR-elemzéseket, hogy meghatározzák a nyelőcsődaganatok specifikus génexpressziós mintázatait, valamint a potenciális biomarkerek expresszióját.

Bakteriális tenyésztés: A mikrobiomnak mint biomarkernek az OESCC-ben betöltött szerepének további megértése érdekében szövetmintákat tenyésztenek a szekvenálás során azonosított baktériumok kimutatására, hogy jelentősen feldúsuljanak a daganatokban. A szövetmintákat aszeptikusan maceráltuk eldobható szikével, és 30 másodpercig vortexeltük PBS-ben (500 l), majd a tiszta szuszpenzióból 10-szeres 2 ) hígításokat készítettek. A tiszta szuszpenziókat (50 l) véragarra (BA), igényes anaerob agarra (FAA) (BA és FAA 5% defibrinált birkavérrel kiegészítve; TCS Biosciences Ltd.) és Sabouraud-agarra (Lab MTM; International Diagnostics Group) kentük. plc). A minták hígításait és végső PBS-mosásait (lásd fent) BA-ra és FAA-ra kentük. A BA és Sabouraud-agar lemezeket aerob körülmények között inkubáltuk 37 °C-on 48 órán át. Az FAA lemezeket anaerob kamrában 36 °C-on 96 órán át inkubáltuk.

Eredményintézkedések

1. A loko-regionális kiújulásmentes túlélést a diagnózis felállításától a kiújulás időpontjáig lokálisan, regionálisan vagy helyi és regionálisan rögzítik.
2. A betegség-specifikus túlélést a diagnózis felállításától az OESCC általi halálozásig rögzítik.
3. A teljes túlélést a diagnózis felállításától a minden okból bekövetkezett halálozásig rögzítik.

Statisztikai elemzés A mikrobák, a műtéti kezelés és az egyének metaadatai (például nem, életkor, dohányzás, alkoholfogyasztás, T/N stádiumok, túlélés, kiújulás) közötti összefüggést az ordináció, a nem-paraméteres többváltozós varianciaanalízis keverékével elemzik, mátrix korreláció, khi-négyzet teszt, általánosított lineáris modell vagy feltételes logisztikus regressziós modellek. A végső biomarkerek teljesítményét keresztellenőrzéssel értékelik, és c-index pontszámmal összegzik, hogy a ROC-görbék segítségével értékeljék a modell és az összehasonlító csoportok közötti összhangot. Minden többszörös tesztelési korrekciót FDR-ek kiszámításával hajtanak végre a BenjaminiHochenberg-módszerrel, és a korrigált p-értékek < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak minősülnek.