Mikrobiom raka płaskonabłonkowego przełyku

Rak przełyku znacząco przyczynia się do globalnego rankingu obciążenia rakiem jako szósta najczęstsza przyczyna globalnej śmierci związanej z rakiem. Rak płaskonabłonkowy przełyku (OESCC) jest jednym z najczęstszych typów raka górnego odcinka przewodu pokarmowego (UGI) w niektórych regionach świata, zwłaszcza w Chinach i Japonii w Azji. Choroba ma bardzo złe rokowania, z całkowitym odsetkiem 5-letnich przeżyć poniżej 30%, głównie ze względu na późne stadium rozpoznania i duże prawdopodobieństwo przerzutów odległych. Chociaż OESCC wiąże się z czynnikami ryzyka, takimi jak palenie tytoniu i alkohol, etiologia OESCC jest nadal słabo poznana.

Coraz więcej dowodów wskazuje na kluczową rolę mikroflory bakteryjnej w karcynogenezie. Pojawiające się dane implikują ludzki mikrobiom w różnych nowotworach, w szczególności Fusobacterium w raku jelita grubego i Helicobacter w raku żołądka. Konsorcjum mikrobiomu bakteryjnego kolonizującego przewód pokarmowy jest rozległe i oddziałuje w sposób złożony. Mikrobiom może wchodzić w interakcje z czynnikami genetycznymi i środowiskowymi, między innymi metabolizując składniki diety i ksenobiotyki. Kiedy równowaga mikrobiologiczna jest zaburzona, mikroflora może zmienić proliferację i śmierć komórek gospodarza, manipulować układem odpornościowym i wpływać na metabolizm gospodarza, powodując raka. Kilka badań wykazało ważną rolę ludzkiej mikroflory w raku górnego odcinka przewodu pokarmowego i wykazało powiązania między mikrobiomem a niektórymi chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak zapalenie przełyku i przełyk Barretta, a także z dysplazją płaskonabłonkową i rakiem płaskonabłonkowym przełyku. Jeszcze mniej znana jest rola mikrobiomu grzybów w OESCC.

W tym przypadku badacze będą starali się ocenić rolę mikrobiomu bakteryjnego i grzybowego w OESCC oraz interakcje mikroorganizmów gospodarza, które mogą odgrywać rolę w zrozumieniu i leczeniu OESCC.

Pytania do nauki:

1. Czy mikrobiom różni się między OESCC a zdrowymi pacjentami?
2. Czy mikrobiom zmienia się od normalnego przez stan przednowotworowy do nowotworowego?
3. Jakie mechanizmy są zaangażowane w mikrobiom i rozwój lub progresję OESCC?

Projekt badania:

To jest badanie prospektywne. Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.

Pacjenci będą rekrutowani ze szpitala Prince of Wales od czerwca 2020 do maja 2025. 100 pacjentów z nowo zdiagnozowaną OESCC lub dysplazją płaskonabłonkową przełyku zostanie zwerbowanych do grupy testowej. Do grupy kontrolnej zostanie włączonych 100 pacjentów poddanych badaniu przełykowo-gastroduodenoskopowemu (OGD) bez historii choroby nowotworowej. Przewidywany czas uczestnictwa w kursie to mniej niż dwa miesiące.

Badanie ma dwie wizyty, jak następuje:

1. Wizyta 1:

   I. Omówić projekt i podpisać formularz świadomej zgody; II. Do zbierania płynu do płukania jamy ustnej 20 ml; iii. Aby wypełnić kwestionariusz: Gut Microbe - Ankieta medyczna i zdrowotna.

2. Wizyta 2:

Mieć OGD. Wizyta 2 odbędzie się w ciągu dwóch miesięcy po Wizycie 1 i musi być przed leczeniem.

I. Grupa badana: Z badaniem zmiany z biopsją guza, biopsją sąsiadującej normalnej tkanki, przepłukać normalną solą fizjologiczną.

II. Grupa kontrolna: Zostanie wykonana biopsja normalnej tkanki i przepłukana normalną solą fizjologiczną.

Uzasadnienie wielkości próbki:

Jest to badanie prospektywne bez wcześniejszych danych opartych na OESCC. Jednak w oparciu o dane dotyczące raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) z pewnym nakładaniem się tradycyjnych czynników ryzyka, badacze celują w rekrutację co najmniej 100 pacjentów z OESCC i 100 zdrowych osób. W badaniu HNSCC wykorzystującym 54 tkanki nowotworowe HNSCC i przylegające do nich zdrowe tkanki wygenerowano krótkie odczyty 16S rRNA, które są w stanie odróżnić przypadki od kontroli. W tkankach nowotworowych zaobserwowano łącznie 77 rodzajów bakterii ze średnią względną liczebnością >0,1%. Analiza rozrzedzenia wykazała, że ​​co najmniej 73 rodzaje można wykryć z dowolnej z 35 próbek, co sugeruje, że rekrutacja 100 pacjentów i 100 kontroli spełnia zminimalizowaną wielkość próbki, aby zawierała prawie pełne spektrum bakterii jamy ustnej i oczekuje się, że będzie miała moc 0,8 i poziom ufności 95%, aby scharakteryzować dysbiozę mikroflory jamy ustnej między przypadkami i kontrolami.

Niezależne zmienne

Następujące zmienne niezależne zostaną zbadane w celu oceny związku panelu metylacji i OESCC:

1. Czynniki kliniczne: stopień zaawansowania choroby TNM, choroby współistniejące;
2. Czynniki ryzyka raka: palenie papierosów, spożywanie alkoholu;
3. Czynniki pacjenta: płeć, wiek;
4. Charakterystyka histologiczna: głębokość guza, rozprzestrzenianie się pozatorebkowe, inwazja naczyń limfatycznych, inwazja okołonerwowa.

Próbki:

Płukanie jamy ustnej: Przed zabiegiem należy wykonać płukanie jamy ustnej, prosząc wszystkich pacjentów o przepłukanie jamy ustnej 20 ml soli fizjologicznej. Otrzymany roztwór należy zachować do późniejszej analizy.

Procedury endoskopowe Procedury endoskopowe będą wykonywane przez lekarzy posiadających doświadczenie w wykonywaniu endoskopii górnych dróg oddechowych. Zostałoby przeprowadzone w Combined Endoscopy Center, Prince of Wales Hospital. Miejscowe znieczulenie miejscowe zostanie zastosowane do jamy ustnej i gardła. Stosowane byłyby endoskopy z powiększeniem/dual focus i funkcją NBI. Miękka czarna osłona byłaby przymocowana do końcówki endoskopu w celu lepszej regulacji ogniskowej.

Pacjenci z grupy testowej przechodzili następnie endoskopię z jedną biopsją guza i jedną biopsją przylegającej normalnej błony śluzowej przełyku. Ponadto należy wykonać płukanie przełyku poprzez delikatne przepłukanie przełyku 20 ml normalnej soli fizjologicznej i odessanie płynu oraz pobranie go do analizy.

Pacjenci z grupy kontrolnej byli poddawani endoskopii zgodnie ze zwykłą praktyką kliniczną. Jedna biopsja zostanie pobrana z normalnej błony śluzowej przełyku do analizy. Podobnie przeprowadza się płukanie przełyku.

Eksperymenty Ekstrakcja DNA i modyfikacja wodorosiarczynem: DNA ze świeżej tkanki i śliny poddanej mikrodysekcji zostanie wyekstrahowane fenolem-chloroformem, wytrącone w 100% etanolu, odwirowane przy 5100 obr./min przez 45 minut, dwukrotnie przemyte w 70% etanolu, rozpuszczone w buforze LoTE (10 mM TRIS chlorowodorek, 1 mM bufor EDTA, pH 8) i przechowywano w temperaturze -80°C.

Ekstrakcja RNA: Świeża tkanka będzie przechowywana w RNAlater w celu ekstrakcji RNA i przechowywana w -80°C.

Analiza genomowa: Wykorzystanie analizy sekwencjonowania nowej generacji do aberracji liczby kopii i zmian pojedynczych nukleotydów do analizy próbek zebranych przy użyciu masowego sekwencjonowania równoległego typu shotgun, jak opisano wcześniej. Wykorzystamy również sekwencjonowanie do analizy mikroflory kohorty. Sekwencjonowanie bakteryjnego genu 16S rRNA: Podwielokrotność DNA zostanie wykorzystana do przeszukiwania społeczności drobnoustrojów w jamie ustnej przy użyciu sekwencjonowania amplikonu genu 16S rRNA regionu V3-V4 24. QIIME2 z najnowszą bazą danych rybosomalnego RNA Silva zostanie wykorzystany do sklasyfikowania wariantu sekwencji amplikonu, z operacyjną tabelą taksonomiczną pokazującą odsetek odczytów bakteryjnych na próbkę. Sekwencjonowanie genu Mycobiota ITS: będziemy celować w wewnętrzny transkrybowany gen rozdzielający (ITS) mycobiota, aby scharakteryzować społeczność grzybów jamy ustnej. Krótki region ITS1 (~270 bp) będzie amplifikowany PCR i sekwencjonowany przy użyciu MiSeq. Odczyty zostaną przetworzone w oparciu o grzybową bazę danych UNITE, a tabele klasyfikacyjne zostaną wygenerowane na poziomie gatunku, rodzaju i OTU do analiz statystycznych.

Analiza ekspresji: Badacze ustalą, czy te zmienione genomowo nowotwory wykazują ekspresję specyficznych zmian w białkach sygnałowych za pomocą barwienia immunohistochemicznego (IHC) i profilowania białek za pomocą macierzy białek. Skrawki FFPE lub zamrożone tkanki zostaną zebrane wraz z badaniem charakterystyki genomu do analiz IHC lub profilowania białek. Do analizy IHC lub profilowania białek wykorzystanych zostanie łącznie 5 szkiełek FFPE do IHC lub ekstrakcji białek w celu profilowania białek, jak wcześniej opublikowano. RNA zostanie wyekstrahowane i poddane analizom RNA, w tym RNA-seq, macierzom ekspresyjnym i analizom RT-PCR, w celu określenia specyficznych wzorców ekspresji genów guzów przełyku, a także ekspresji potencjalnych biomarkerów.

Hodowla bakteryjna: Aby dokładniej zrozumieć rolę mikrobiomu jako biomarkera w próbkach tkanek OESCC, będą hodowane pod kątem bakterii zidentyfikowanych podczas sekwencjonowania w celu znacznego wzbogacenia w nowotwory. Próbki tkanek macerowano aseptycznie jednorazowymi skalpelami i worteksowano przez 30 sekund w PBS (500 ul), a czyste zawiesiny stosowano do sporządzania 10-krotnych 2) rozcieńczeń. Czyste zawiesiny (50 l) rozprowadzono na agarze z krwią (BA), agarze beztlenowym o wysokich wymaganiach (FAA) (BA i FAA z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej; TCS Biosciences Ltd.) i agarze Sabourauda (Lab MTM; International Diagnostics Group) plc). Rozcieńczenia i końcowe przemycia PBS próbek (patrz powyżej) rozprowadzono na BA i FAA. Płytki z agarem BA i Sabourauda inkubowano w warunkach tlenowych w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Płytki FAA inkubowano w komorze beztlenowej w temperaturze 36°C przez 96 godzin.

Miary wyników

1. Przeżycie wolne od nawrotów miejscowo-regionalnych będzie rejestrowane od czasu rozpoznania do czasu nawrotu lokalnie, regionalnie lub lokalnie i regionalnie.
2. Przeżycie specyficzne dla choroby będzie rejestrowane od momentu diagnozy do czasu śmierci z OESCC.
3. Całkowity czas przeżycia będzie rejestrowany od momentu rozpoznania do czasu zgonu ze wszystkich przyczyn.

Analiza statystyczna Związek między drobnoustrojami, leczeniem chirurgicznym i metadanymi poszczególnych osób (np. płeć, wiek, palenie, picie, etapy T/N, przeżycie, nawrót) zostanie przeanalizowany przy użyciu kombinacji ordynacji, nieparametrycznej wielowymiarowej analizy wariancji, korelacja macierzowa, test chi-kwadrat, uogólniony model liniowy lub modele warunkowej regresji logistycznej. Wydajność ostatecznych biomarkerów zostanie oceniona przez walidację krzyżową i podsumowana za pomocą wyniku wskaźnika c w celu oceny zgodności między grupami modelowymi i porównawczymi przy użyciu krzywych ROC. Wszystkie wielokrotne poprawki testowe zostaną wykonane przez obliczenie FDR metodą Benjaminiego Hochenberga, a skorygowane wartości p < 0,05 zostaną uznane za statystycznie istotne.