Mikrobiomet af esophageal pladecellecarcinom

Øsophageal carcinom bidrager væsentligt til den globale kræftbyrdeplacering som den sjette hyppigste årsag til global kræftrelateret død. Øsophageal pladecellekarcinom (OESCC) er en af ​​de mest almindelige typer af øvre gastrointestinale (UGI) karcinomer i nogle regioner globalt, især Kina og Japan i Asien. Sygdommen har en ekstremt dårlig prognose, med en samlet 5-års overlevelsesrate på mindre end 30%, hovedsageligt på grund af det sene stadie ved diagnosen og høj sandsynlighed for fjernmetastaser. Selvom OESCC er forbundet med risikofaktorer, herunder rygning og alkohol, er ætiologien af ​​OESCC stadig dårligt forstået.

Stigende beviser indikerer en nøglerolle for bakteriel mikrobiota i carcinogenese. Nye data implicerer det menneskelige mikrobiom i en række kræftformer, især Fusobacterium i tyktarmskræft og Helicobacter i mavekræft. Konsortiet af bakteriel mikrobiom, der koloniserer mave-tarmkanalen, er omfattende og interagerer på en kompleks måde. Mikrobiomet kan interagere med genetiske og miljømæssige faktorer for at metabolisere kostbestanddele og xenobiotika, blandt andre funktioner. Når den mikrobielle balance er forstyrret, kan mikrobiotaen ændre værtscelleproliferation og død, manipulere immunsystemet og påvirke værtsmetabolisme, hvilket giver anledning til carcinom. Adskillige undersøgelser har rapporteret en vigtig rolle for den menneskelige mikrobiota i øvre gastrointestinale carcinomer og fundet sammenhænge mellem mikrobiotaen og nogle sygdomme i UGI-kanalen, såsom esophagitis og Barrett esophagus, og med pladeepiteldysplasi og pladecellekarcinom i spiserøret. En anden endnu mindre kendt er svampemikrobiomets rolle i OESCC.

Her vil efterforskerne søge at evaluere bakterie- og svampemikrobiomets rolle i OESCC og værtsmikrobeinteraktionerne, der kan spille en rolle i forståelsen og håndteringen af ​​OESCC.

Studiespørgsmål:

1. Er mikrobiomet forskelligt mellem OESCC og normale patienter?
2. Ændrer mikrobiomet sig fra normalt gennem præmalignitet til malignitet?
3. Hvad er mekanismerne involveret i mikrobiomet og udviklingen eller progressionen af ​​OESCC?

Studere design:

Dette er en prospektiv undersøgelse. Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

Patienter vil blive rekrutteret fra Prince of Wales Hospital fra juni 2020 til maj 2025. 100 patienter med nydiagnosticeret OESCC eller oesophageal squamous dysplasi vil blive rekrutteret til testgruppen. 100 patienter, der gennemgår en oesophagogastroduodenoskopi (OGD) uden en anamnese med malignitet, vil blive rekrutteret til kontrolgruppen. Den forventede varighed af fagdeltagelse er mindre end to måneder.

Undersøgelsen har to besøg, som følger:

1. Besøg 1:

   jeg. At diskutere om projektet og at underskrive den informerede samtykkeformular; ii. For at indsamle oral skylning 20ml; iii. For at udfylde spørgeskema: Gut Microbe - Medicinsk og sundhedsspørgeskema.

2. Besøg 2:

At have OGD. Besøg 2 vil blive udført inden for to måneder efter besøg 1 og skal før behandling.

jeg. Testgruppe: Med undersøgelse af læsionen med biopsi af tumor, biopsi af tilstødende normalt væv, skyl med normalt saltvand.

ii. Kontrolgruppe: Vil have en biopsi af normalt væv og skylles med normalt saltvand.

Begrundelse for prøvestørrelse:

Dette er en prospektiv undersøgelse uden tidligere data baseret på OESCC. Men baseret på data fra hoved- og halspladecellecarcinom (HNSCC) med en vis overlapning i traditionelle risikofaktorer sigter efterforskerne efter at rekruttere mindst 100 OESCC-patienter og 100 raske forsøgspersoner. I et HNSCC-studie med 54 HNSCC-tumorvæv og det tilstødende normale væv har man genereret 16S rRNA-kortlæsninger i stand til at skelne tilfælde fra kontroller. I alt 77 bakterieslægter med > 0,1 % gennemsnitlig relativ overflod blev observeret i tumorvæv. En sjældenhedsanalyse indikerede, at mindst 73 slægter kan påvises fra enhver af 35 prøver, hvilket tyder på, at rekruttering af 100 patienter og 100 kontroller opfylder den minimerede prøvestørrelse til at indeholde næsten hele spektret af orale bakterier og forventes at have en styrke på 0,8 og konfidensniveau på 95 % for at karakterisere oral mikrobiota dysbiose mellem tilfælde og kontroller.

Uafhængige variabler

Følgende uafhængige variabler vil blive undersøgt for at evaluere sammenhængen mellem methyleringspanelet og OESCC:

1. Kliniske faktorer: TNM-stadieinddeling af sygdom, komorbiditeter;
2. Kræftrisikofaktorer: rygehistorie, alkoholforbrug;
3. Patientfaktorer: køn, alder;
4. Histologiske karakteristika: tumordybde, ekstrakapsulær spredning, lymfovaskulær invasion, perineural invasion.

Prøver:

Mundskylning: Før proceduren udføres en mundskylning ved at bede alle patienter om at skylle mundhulen med 20 ml normalt saltvand. Den resulterende opløsning vil blive opbevaret til efterfølgende analyse.

Endoskopiske procedurer Endoskopiske procedurer vil blive udført af læger med ekspertise i at udføre øvre endoskopi. Det ville blive udført på Combined Endoscopy Center, Prince of Wales Hospital. Lokal lokalbedøvelse vil blive påført oropharynx. Endoskoper med forstørrelse/dobbelt fokus og NBI-funktion ville blive brugt. En blød sort hætte ville blive fastgjort til spidsen af ​​endoskopet for bedre brændviddejustering.

Patienter i testgruppen ville derefter gennemgå endoskopi med én biopsi af tumoren og én biopsi af den tilstødende normale esophageal slimhinde. Derudover vil esophageal skylning også blive udført ved at skylle esophagus forsigtigt med 20 ml normalt saltvand, og væsken suges og opsamles til analyse.

Patienter i kontrolgruppen ville gennemgå endoskopi som pr. sædvanlig klinisk praksis. En biopsi ville blive taget fra normal esophageal slimhinde til analyse. På samme måde ville der blive udført esophageal skylning.

Eksperimenter DNA-ekstraktion og bisulfitmodifikation: DNA fra mikrodissekeret frisk væv og spyt vil blive ekstraheret med phenol-chloroform, præcipiteret i 100 % ethanol, centrifugeret ved 5100 rpm i 45 minutter, vasket i 70 % ethanol to gange, opløst i LoTE-buffer (10 mM TRIS). hydrochlorid, 1 mM EDTA-buffer, pH 8), og opbevaret ved -80°C.

RNA-ekstraktion: Frisk væv vil blive opbevaret i RNAlater til ekstraktion af RNA og opbevaret i -80°C.

Genomisk analyse: Anvendelse af næste generations sekventeringsanalyse til kopiantal aberrationer og enkeltnukleotidvariationer til at analysere prøverne indsamlet ved hjælp af shotgun massiv parallel sekventering som tidligere beskrevet. Vi vil også bruge sekventering til at analysere kohortens mikrobiota. Bakteriel 16S rRNA gensekventering: En alikvot af DNA vil blive brugt til at screene oralt mikrobielt samfund ved hjælp af 16S rRNA gen V3-V4 region amplikon sekventering 24. QIIME2 med den seneste Silva ribosomale RNA-database vil blive brugt til at klassificere amplikonsekvensvarianter med operationel taksonomisk tabel, der viser andelen af ​​bakteriel aflæsninger pr. prøve. Mycobiota ITS-gensekventering: vi vil målrette mycobiota internt transskriberet spacer-gen (ITS) for at karakterisere oralt svampesamfund. En kort region af ITS1 (~270 bp) vil blive PCR-amplificeret og sekventeret ved hjælp af MiSeq. Aflæsningerne vil blive behandlet mod en svampe UNITE-database, og klassifikationstabellerne vil blive genereret på arts-, slægts- og OTU-niveau til statistiske analyser.

Ekspressionsanalyse: Forskerne vil afgøre, om disse genomisk ændrede tumorer udtrykker specifikke ændringer i signalproteiner ved hjælp af immunhistokemisk farvning (IHC) og proteinprofilering ved hjælp af proteinarrays. FFPE-sektioner eller frosne væv vil blive høstet til sideløbende med genomisk karakteriseringsundersøgelse til IHC-analyser eller proteinprofilering. Til IHC-analyse eller proteinprofilering vil i alt 5 FFPE-slides blive brugt til IHC eller proteinekstraktion til proteinprofilering som tidligere offentliggjort. RNA vil blive ekstraheret og underkastet RNA-analyser, herunder RNA-seq, expression array og RT-PCR analyser for at bestemme specifikke genekspressionsmønstre for esophageal tumorer, såvel som ekspression af potentielle biomarkører.

Bakteriekultur: For yderligere at forstå mikrobiomets rolle som en biomarkør i OESCC-vævsprøver vil der blive dyrket, så bakterier identificeret i sekventering bliver betydeligt beriget i tumorer. Vævsprøver blev aseptisk macereret med engangsskalpeller og hvirvlet i 30 sekunder i PBS (500 l), og de rene suspensioner blev brugt til at lave 10 gange 2 ) fortyndinger. Pæne suspensioner (50 l) blev hver spredt på blodagar (BA), kræsen anaerob agar (FAA) (BA og FAA suppleret med 5 % defibrineret fåreblod; TCS Biosciences Ltd.) og Sabouraud's agar (Lab MTM; International Diagnostics Group plc). Fortyndingerne og de endelige PBS-vaske af prøverne (se ovenfor) blev spredt på BA og FAA. BA og Sabouraud's agarplader blev inkuberet aerobt ved 37°C i 48 timer. FAA-plader blev inkuberet i et anaerobt kabinet ved 36°C i 96 timer.

Resultatmål

1. Lokoregional recidivfri overlevelse vil blive registreret fra diagnosetidspunktet til tidspunktet for recidiv lokalt, regionalt eller lokalt og regionalt.
2. Sygdomsspecifik overlevelse vil blive registreret fra diagnosetidspunktet til dødstidspunktet fra OESCC.
3. Samlet overlevelse vil blive registreret fra tidspunktet for diagnosen til tidspunktet for døden af ​​alle årsager.

Statistisk analyse Sammenhæng mellem mikrober, kirurgisk behandling og individers metadata (f.eks. køn, alder, rygning, drikkeri, T/N-stadier, overlevelse, tilbagefald) vil blive analyseret ved hjælp af en blanding af ordination, ikke-parametrisk multivariat variansanalyse, matrixkorrelation, chi-kvadrattest, generaliseret lineær model eller betinget logistisk regressionsmodeller. Ydeevnen af ​​de endelige biomarkører vil blive vurderet ved krydsvalidering og opsummeret med c-indeksscore for at vurdere overensstemmelsen mellem model- og sammenligningsgrupper ved hjælp af ROC-kurver. Alle multiple testkorrektioner vil blive udført ved at beregne FDR'er ved hjælp af BenjaminiHochenberg-metoden, og justerede p-værdier < 0,05 vil blive betragtet som statistisk signifikante.