Ruokatorven okasolusyövän mikrobiomi

Ruokatorven syöpä lisää merkittävästi maailmanlaajuista syöpätaakkaa, joka on kuudenneksi suurin maailmanlaajuisten syöpäkuolemien syy. Ruokatorven levyepiteelisyöpä (OESCC) on yksi yleisimmistä ylemmän maha-suolikanavan (UGI) karsinooman tyypeistä joillakin alueilla maailmanlaajuisesti, erityisesti Kiinassa ja Japanissa Aasiassa. Taudin ennuste on erittäin huono, ja 5 vuoden kokonaiseloonjäämisaste on alle 30 %, mikä johtuu pääasiassa diagnoosin myöhäisestä vaiheesta ja kaukaisten etäpesäkkeiden suuresta todennäköisyydestä. Vaikka OESCC liittyy riskitekijöihin, kuten tupakointiin ja alkoholiin, OESCC:n etiologiaa ymmärretään edelleen huonosti.

Kasvava näyttö osoittaa, että bakteerimikrobiotalla on keskeinen rooli karsinogeneesissä. Uusien tietojen mukaan ihmisen mikrobiomi liittyy useisiin syöpiin, joista merkittävin on Fusobacterium kolorektaalisyövässä ja helikobakteeri mahasyövässä. Ruoansulatuskanavaa kolonisoiva bakteerimikrobiomikonsortio on laaja ja vuorovaikuttaa monimutkaisella tavalla. Mikrobiomi voi olla vuorovaikutuksessa geneettisten ja ympäristötekijöiden kanssa metaboloidakseen ravinnon aineosia ja ksenobiootteja muiden toimintojen ohella. Kun mikrobitasapaino häiriintyy, mikrobiota voi muuttaa isäntäsolujen lisääntymistä ja kuolemaa, manipuloida immuunijärjestelmää ja vaikuttaa isännän aineenvaihduntaan aiheuttaen karsinooman. Useat tutkimukset ovat raportoineet ihmisen mikrobiotan tärkeästä roolista ylemmän maha-suolikanavan karsinoomassa ja löytäneet yhteyksiä mikrobiotan ja joidenkin UGI-kanavan sairauksien, kuten ruokatorven ja Barrettin ruokatorven sairauksien, sekä ruokatorven levyepiteelimäisen dysplasian ja levyepiteelikarsinooman välillä. Toinen vielä vähemmän tunnettu on sienimikrobiomin rooli OESCC:ssä.

Tässä tutkijat pyrkivät arvioimaan bakteeri- ja sienimikrobiomin roolia OESCC:ssä ja isäntämikrobien vuorovaikutuksia, joilla voi olla rooli OESCC:n ymmärtämisessä ja hallinnassa.

Opintokysymykset:

1. Onko mikrobiomi eroa OESCC:n ja tavallisten potilaiden välillä?
2. Muuttuuko mikrobiomi normaalista premaligniteettiin pahanlaatuiseksi?
3. Mitkä ovat mikrobiomiin ja OESCC:n kehitykseen tai etenemiseen liittyvät mekanismit?

Opintojen suunnittelu:

Tämä on tulevaisuudentutkimus. Tutkimus toteutetaan Helsingin julistuksen mukaisesti.

Potilaita rekrytoidaan Prince of Walesin sairaalasta kesäkuusta 2020 toukokuuhun 2025. Testiryhmään otetaan 100 potilasta, joilla on äskettäin diagnosoitu OESCC tai ruokatorven levyepiteeli. Verrokkiryhmään valitaan 100 potilasta, joille tehdään esophagogastroduodenoscopy (OGD), joilla ei ole ollut pahanlaatuisia kasvaimia. Aiheeseen osallistumisen arvioitu kesto on alle kaksi kuukautta.

Tutkimuksessa on kaksi käyntiä seuraavasti:

1. Käynti 1:

   i. Keskustella hankkeesta ja allekirjoittaa tietoinen suostumuslomake; ii. Suuhuuhteluveden keräämiseen 20ml; iii. Kyselyn täyttäminen: Gut Microbe - Lääketieteellinen ja terveyskysely.

2. Vierailu 2:

Saadaksesi OGD:n. Käynti 2 suoritetaan kahden kuukauden kuluessa käynnistä 1 ja se on tehtävä ennen hoitoa.

i. Testiryhmä: Tutkitaan vaurio biopsialla kasvaimesta, biopsia viereisestä normaalista kudoksesta, huuhdellaan normaalilla suolaliuoksella.

ii. Kontrolliryhmä: Otetaan biopsia normaalista kudoksesta ja huuhdellaan normaalilla suolaliuoksella.

Näytteen koon perustelu:

Tämä on prospektiivinen tutkimus, jossa ei ole aikaisempaa OESCC:hen perustuvaa tietoa. Mutta pään ja kaulan levyepiteelisyöpää (HNSCC) koskevien tietojen perusteella, joissa perinteisissä riskitekijöissä on jonkin verran päällekkäisyyksiä, tutkijat pyrkivät rekrytoimaan vähintään 100 OESCC-potilasta ja 100 tervettä henkilöä. HNSCC-tutkimuksessa, jossa käytettiin 54 HNSCC-kasvainkudosta ja viereisiä normaaleja kudoksia, on syntynyt 16S-rRNA-lyhyitä lukuja, jotka pystyvät erottamaan tapaukset kontrolleista. Kasvainkudoksissa havaittiin yhteensä 77 bakteerisukua, joiden keskimääräinen suhteellinen runsaus oli >0,1 %. Harvinaisuuksien analyysi osoitti, että vähintään 73 sukua voidaan havaita mistä tahansa 35 näytteestä, mikä viittaa siihen, että 100 potilaan ja 100 kontrollin rekrytointi täyttää minimoidun näytteen koon sisältämään lähes täyden kirjon suun bakteereja ja että sen tehon odotetaan olevan 0,8 ja 95 %:n luotettavuustaso luonnehtimaan suun mikrobiotan dysbioosia tapausten ja kontrollien välillä.

Riippumattomat muuttujat

Seuraavat riippumattomat muuttujat tutkitaan metylaatiopaneelin ja OESCC:n välisen yhteyden arvioimiseksi:

1. Kliiniset tekijät: sairauden TNM-vaiheistus, liitännäissairaudet;
2. Syövän riskitekijät: tupakointihistoria, alkoholin käyttö;
3. Potilaan tekijät: sukupuoli, ikä;
4. Histologiset ominaisuudet: kasvaimen syvyys, ekstrakapsulaarinen leviäminen, lymfavaskulaarinen invaasio, perineuraalinen invaasio.

Näytteet:

Suuhuuhtelu: Ennen toimenpidettä suuhuuhtelu suoritetaan pyytämällä kaikkia potilaita huuhtelemaan suuontelo 20 ml:lla normaalia suolaliuosta. Saatu liuos säilytetään myöhempää analyysiä varten.

Endoskooppiset toimenpiteet Endoskooppiset toimenpiteet suorittaisivat ylemmän endoskopian suorittamiseen perehtyneet lääkärit. Se suoritettaisiin Prince of Walesin sairaalan yhdistetyssä endoskopiakeskuksessa. Paikallinen paikallispuudutus levitetään suunieluun. Käytettäisiin endoskooppeja, joissa on suurennus/kaksoistarkennus ja NBI-toiminto. Pehmeä musta huppu kiinnitettäisiin endoskoopin kärkeen polttovälin parempaa säätämistä varten.

Testiryhmän potilaille tehtiin sitten endoskopia ja yksi biopsia kasvaimesta ja yksi biopsia viereisestä normaalista ruokatorven limakalvosta. Lisäksi ruokatorven huuhtelu suoritettaisiin myös huuhtelemalla ruokatorvi varovasti 20 ml:lla normaalia suolaliuosta ja neste imetään ja kerätään analyysiä varten.

Kontrolliryhmän potilaille tehtiin endoskopia tavallisen kliinisen käytännön mukaisesti. Normaalista ruokatorven limakalvosta otettaisiin yksi biopsia analysointia varten. Samalla tavalla suoritettaisiin ruokatorven huuhtelu.

Kokeet DNA:n uutto ja bisulfiitin modifiointi: DNA uutetaan mikrodissektoiduista tuoreista kudoksista ja syljestä fenoli-kloroformilla, saostetaan 100 % etanolissa, sentrifugoidaan 5100 rpm 45 minuuttia, pestään 70 % etanolissa kahdesti, liuotetaan LoTE TRIS -puskuriin (10 mM) hydrokloridi, 1 mM EDTA-puskuri, pH 8) ja säilytettiin -80 °C:ssa.

RNA:n uuttaminen: Tuore kudos säilytetään RNAlaterissa RNA:n uuttamista varten ja säilytetään -80 °C:ssa.

Genominen analyysi: Hyödynnetään seuraavan sukupolven sekvensointianalyysiä kopiolukupoikkeamien ja yksittäisten nukleotidien vaihteluiden selvittämiseksi näytteiden analysoimiseksi, jotka on kerätty käyttämällä haulikkomassiivista rinnakkaissekvensointia aiemmin kuvatulla tavalla. Käytämme myös sekvensointia kohortin mikrobiston analysointiin. Bakteerin 16S-rRNA-geenin sekvensointi: DNA-eriä käytetään suun mikrobiyhteisön seulomiseen käyttämällä 16S-rRNA-geenin V3-V4-alueen amplikonin sekvensointia 24. QIIME2:ta uusimman Silvan ribosomaalisen RNA-tietokannan kanssa käytetään amplikonisekvenssivarianttien luokittelemiseen, ja operatiivisessa taksonomisessa taulukossa näkyy bakteerilukemien osuus näytettä kohti. Mycobiota ITS -geenisekvensointi: kohdistamme mycobiotan sisäisen transkriptoidun välikegeenin (ITS) luonnehtimaan suun sieniyhteisöä. Lyhyt ITS1-alue (~270 bp) monistetaan PCR:llä ja sekvensoidaan käyttämällä MiSeq:ia. Lukemat käsitellään sieni-UNITE-tietokantaa vastaan ​​ja luokitustaulukot luodaan laji-, suku- ja OTU-tasolla tilastollisia analyyseja varten.

Ekspressioanalyysi: Tutkijat määrittävät, ilmentävätkö nämä genomillisesti muuttuneet kasvaimet spesifisiä muutoksia signalointiproteiineissa käyttämällä immunohistokemiallista värjäystä (IHC) ja proteiinien profilointia proteiiniryhmien avulla. FFPE-leikkeet tai pakastetut kudokset kerätään IHC-analyysejä tai proteiiniprofilointia varten tehtävän genomisen karakterisointitutkimuksen ohella. IHC-analyysiä tai proteiiniprofilointia varten käytetään yhteensä 5 FFPE-levyä IHC:tä tai proteiinien uuttamista varten proteiinien profilointia varten, kuten aiemmin on julkaistu. RNA uutetaan ja sille tehdään RNA-analyysejä, mukaan lukien RNA-seq-, ekspressio- ja RT-PCR-analyysit, jotta voidaan määrittää ruokatorven kasvainten spesifiset geeniekspressiomallit sekä mahdollisten biomarkkerien ilmentyminen.

Bakteeriviljely: Jotta voitaisiin ymmärtää paremmin mikrobiomin rooli biomarkkerina OESCC:ssä, kudosnäytteitä viljellään sekvensoinnissa tunnistettuja bakteereja varten, jotka ovat merkittävästi rikastuneet kasvaimissa. Kudosnäytteet maseroitiin aseptisesti kertakäyttöisillä skalpellilla ja vorteksoitiin 30 sekuntia PBS:ssä (500 1), ja puhtaita suspensioita käytettiin 10-kertaisten 2 ) laimennosten tekemiseen. Puhtaat suspensiot (50 l) levitettiin kukin veri-agarille (BA), vaativalle anaerobeille agarille (FAA) (BA ja FAA täydennettynä 5 % defibrinoidulla lampaanverellä; TCS Biosciences Ltd.) ja Sabouraud-agarille (Lab MTM; International Diagnostics Group). plc). Näytteiden laimennokset ja lopulliset PBS-pesut (katso edellä) levitettiin BA:lle ja FAA:lle. BA- ja Sabouraud'n agarmaljoja inkuboitiin aerobisesti 37 °C:ssa 48 tuntia. FAA-levyjä inkuboitiin anaerobisessa kaapissa 36 °C:ssa 96 tuntia.

Tulostoimenpiteet

1. Lokoalueellinen uusiutumisvapaa eloonjääminen kirjataan diagnoosihetkestä uusiutumishetkeen paikallisesti, alueellisesti tai paikallisesti ja alueellisesti.
2. Tautikohtainen eloonjääminen kirjataan diagnoosista OESCC:n kuolemaan asti.
3. Kokonaiseloonjääminen kirjataan diagnoosista kaikista syistä kuolemaan asti.

Tilastollinen analyysi Mikrobien, leikkaushoidon ja yksilöiden metatietojen (esim. sukupuoli, ikä, tupakointi, juominen, T/N-vaiheet, eloonjääminen, uusiutuminen) välistä yhteyttä analysoidaan käyttämällä yhdistelmää ordinaatiota, ei-parametrista monimuuttujavarianssianalyysiä, matriisikorrelaatio, khin neliötesti, yleinen lineaarinen malli tai ehdollinen logistinen regressiomalli. Lopullisten biomarkkerien suorituskykyä arvioidaan ristiinvalidoinnilla ja niistä tehdään yhteenveto c-indeksipisteillä mallin ja vertailuryhmien välisen yhteensopivuuden arvioimiseksi käyttämällä ROC-käyriä. Kaikki usean testauksen korjaukset suoritetaan laskemalla FDR:t BenjaminiHochenberg-menetelmällä, ja säädetyt p-arvot < 0,05 katsotaan tilastollisesti merkitseviksi.