El microbioma del carcinoma de células escamosas de esófago

El carcinoma de esófago contribuye significativamente a la clasificación de la carga mundial de cáncer como la sexta causa principal de muerte relacionada con el cáncer a nivel mundial. El carcinoma de células escamosas de esófago (OESCC) es uno de los tipos más comunes de carcinoma gastrointestinal superior (UGI) en algunas regiones del mundo, particularmente en China y Japón en Asia. La enfermedad tiene un pronóstico extremadamente malo, con tasas de supervivencia general a 5 años de menos del 30 %, principalmente debido al estadio tardío en el momento del diagnóstico y la alta probabilidad de metástasis a distancia. Aunque el OESCC se asocia con factores de riesgo, incluidos el tabaquismo y el alcohol, la etiología del OESCC aún no se comprende bien.

La creciente evidencia indica un papel clave para la microbiota bacteriana en la carcinogénesis. Los datos emergentes implican al microbioma humano en una variedad de cánceres, más notablemente Fusobacterium en el cáncer colorrectal y Helicobacter en el cáncer gástrico. El consorcio de microbiomas bacterianos que colonizan el tracto gastrointestinal es extenso e interactúa de manera compleja. El microbioma puede interactuar con factores genéticos y ambientales para metabolizar componentes dietéticos y xenobióticos, entre otras funciones. Cuando se altera el equilibrio microbiano, la microbiota podría alterar la proliferación y muerte de la célula huésped, manipular el sistema inmunitario e influir en el metabolismo del huésped, dando lugar al carcinoma. Varios estudios han informado un papel importante de la microbiota humana en el carcinoma gastrointestinal superior y han encontrado asociaciones entre la microbiota y algunas enfermedades del tracto gastrointestinal, como la esofagitis y el esófago de Barrett, y con displasia escamosa y carcinoma escamoso de esófago. Otro aún menos conocido es el papel del microbioma fúngico en OESCC.

Aquí, los investigadores buscarán evaluar el papel del microbioma bacteriano y fúngico en OESCC y las interacciones del microbio huésped que pueden desempeñar un papel en la comprensión y el manejo de OESCC.

Preguntas de estudio:

1. ¿El microbioma difiere entre OESCC y pacientes normales?
2. ¿El microbioma cambia de normal a premaligno a maligno?
3. ¿Cuáles son los mecanismos involucrados en el microbioma y el desarrollo o progresión de OESCC?

Diseño del estudio:

Este es un estudio prospectivo. El estudio se llevará a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Se reclutarán pacientes del Hospital Prince of Wales desde junio de 2020 hasta mayo de 2025. Se reclutarán 100 pacientes con OESCC o displasia escamosa esofágica recién diagnosticada para el grupo de prueba. 100 pacientes sometidos a esofagogastroduodenoscopia (OGD) sin antecedentes de malignidad serán reclutados para el grupo de control. La duración prevista de la participación de los sujetos es inferior a dos meses.

El estudio consta de dos visitas, así:

1. Visita 1:

   i. Discutir sobre el proyecto y firmar el formulario de consentimiento informado; ii. Para recoger enjuague bucal 20ml; iii. Para completar el cuestionario: Gut Microbe - Cuestionario médico y de salud.

2. Visita 2:

Tener DOG. La Visita 2 se realizará dentro de los dos meses posteriores a la Visita 1 y debe realizarse antes del tratamiento.

i. Grupo de prueba: con examen de la lesión con biopsia de tumor, biopsia de tejido normal adyacente, lavado con solución salina normal.

ii. Grupo de control: tendrá una biopsia de tejido normal y lavado con solución salina normal.

Justificación del tamaño de la muestra:

Este es un estudio prospectivo sin datos previos basado en OESCC. Pero según los datos del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) con cierta superposición en los factores de riesgo tradicionales, los investigadores apuntan a reclutar al menos 100 pacientes con OESCC y 100 sujetos sanos. En el estudio HNSCC que utilizó 54 tejidos tumorales HNSCC y los tejidos normales adyacentes generó lecturas cortas de ARNr 16S capaces de discriminar casos de controles. Se observó un total de 77 géneros bacterianos con una abundancia relativa media >0,1 % en los tejidos tumorales. Un análisis de rarefacción indicó que se pueden detectar al menos 73 géneros de cualquiera de las 35 muestras, lo que sugiere que el reclutamiento de 100 pacientes y 100 controles cumple con el tamaño de muestra mínimo para contener casi todo el espectro de bacterias orales y se espera que tenga una potencia de 0,8 y nivel de confianza del 95% para caracterizar la disbiosis de la microbiota oral entre casos y controles.

Variables independientes

Se examinarán las siguientes variables independientes para evaluar la asociación del panel de metilación y OESCC:

1. Factores clínicos: estadificación TNM de la enfermedad, comorbilidades;
2. Factores de riesgo de cáncer: antecedentes de tabaquismo, consumo de alcohol;
3. Factores del paciente: sexo, edad;
4. Características histológicas: profundidad del tumor, extensión extracapsular, invasión linfovascular, invasión perineural.

Muestras:

Enjuague oral: antes del procedimiento, se realizaría un enjuague bucal pidiendo a todos los pacientes que enjuaguen la cavidad bucal con 20 ml de solución salina normal. La solución resultante se guardaría para análisis posteriores.

Procedimientos endoscópicos Los procedimientos endoscópicos serían realizados por médicos con experiencia en la realización de endoscopia superior. Se llevaría a cabo en el Centro de Endoscopia Combinada del Hospital Prince of Wales. Se aplicará anestesia local tópica en la orofaringe. Se utilizarían endoscopios con aumento/enfoque dual y función NBI. Se adjuntaría una capucha negra suave a la punta del endoscopio para un mejor ajuste de la distancia focal.

Los pacientes en el grupo de prueba luego se someterían a una endoscopia con una biopsia del tumor y una biopsia de la mucosa esofágica normal adyacente. Además, también se realizaría un enjuague esofágico lavando suavemente el esófago con 20 ml de solución salina normal y el líquido se succionaría y recolectaría para su análisis.

Los pacientes del grupo control se someterían a una endoscopia según la práctica clínica habitual. Se tomaría una biopsia de la mucosa esofágica normal para su análisis. De igual forma se realizaría enjuague esofágico.

Experimentos Extracción de ADN y modificación con bisulfito: Se extraerá ADN de tejidos frescos microdiseccionados y saliva con fenol-cloroformo, se precipitará en etanol al 100 %, se centrifugará a 5100 rpm durante 45 minutos, se lavará dos veces en etanol al 70 %, se disolverá en tampón LoTE (TRIS 10 mM clorhidrato, tampón EDTA 1 mM, pH 8), y almacenado a -80°C.

Extracción de ARN: el tejido fresco se almacenará en RNAlater para la extracción de ARN y se almacenará a -80 °C.

Análisis genómico: utilizando el análisis de secuenciación de próxima generación para las aberraciones del número de copias y las variaciones de un solo nucleótido para analizar las muestras recolectadas mediante la secuenciación paralela masiva de escopeta como se describió anteriormente. También utilizaremos la secuenciación para analizar la microbiota de la cohorte. Secuenciación del gen 16S rRNA bacteriano: se usará una alícuota de ADN para examinar la comunidad microbiana oral mediante la secuenciación de amplicón de la región V3-V4 del gen 16S rRNA 24. QIIME2 con la última base de datos de ARN ribosómico de Silva se utilizará para clasificar la variante de secuencia de amplicón, con una tabla taxonómica operativa que muestra la proporción de lecturas bacterianas por muestra. Secuenciación del gen ITS de la micobiota: nos centraremos en el gen espaciador transcrito interno (ITS) de la micobiota para caracterizar la comunidad fúngica oral. Una región corta de ITS1 (~270 pb) se amplificará mediante PCR y se secuenciará con MiSeq. Las lecturas se procesarán en una base de datos UNITE de hongos, y las tablas de clasificación se generarán a nivel de especie, género y OTU para análisis estadísticos.

Análisis de expresión: los investigadores determinarán si estos tumores genómicamente alterados expresan cambios específicos en las proteínas de señalización mediante la tinción inmunohistoquímica (IHC) y el perfil de proteínas mediante matrices de proteínas. Las secciones FFPE o los tejidos congelados se recolectarán junto con el estudio de caracterización genómica para análisis IHC o perfiles de proteínas. Para el análisis IHC o el perfilado de proteínas, se empleará un total de 5 portaobjetos FFPE para IHC o extracción de proteínas para el perfilado de proteínas, como se publicó anteriormente. El ARN se extraerá y se someterá a análisis de ARN, incluidos análisis de RNA-seq, matriz de expresión y RT-PCR para determinar patrones de expresión génica específicos de tumores esofágicos, así como la expresión de biomarcadores potenciales.

Cultivo bacteriano: para comprender mejor el papel del microbioma como biomarcador en las muestras de tejido de OESCC, se cultivarán bacterias identificadas en la secuenciación para que se enriquezcan significativamente en tumores. Las muestras de tejido se maceraron asépticamente con escalpelos desechables y se sometieron a agitación vorticial durante 30 segundos en PBS (500 l), y las suspensiones puras se usaron para hacer diluciones de 10 veces 2 ). Las suspensiones puras (50 l) se esparcieron en agar sangre (BA), agar anaerobio exigente (FAA) (BA y FAA suplementados con sangre de carnero desfibrinada al 5 %; TCS Biosciences Ltd.) y agar de Sabouraud (Lab MTM; International Diagnostics Group Sociedad Anónima). Las diluciones y los lavados finales con PBS de las muestras (ver arriba) se extendieron sobre BA y FAA. Las placas de agar BA y Sabouraud se incubaron aeróbicamente a 37°C durante 48 h. Las placas FAA se incubaron en un gabinete anaeróbico a 36°C durante 96 h.

medidas de resultados

1. La supervivencia libre de recurrencia locorregional se registrará desde el momento del diagnóstico hasta el momento de la recurrencia a nivel local, regional o local y regional.
2. La supervivencia específica de la enfermedad se registrará desde el momento del diagnóstico hasta el momento de la muerte por OESCC.
3. La supervivencia global se registrará desde el momento del diagnóstico hasta el momento de la muerte por todas las causas.

Análisis estadístico La asociación entre los microbios, el tratamiento quirúrgico y los metadatos de las personas (p. ej., sexo, edad, tabaquismo, consumo de alcohol, estadios T/N, supervivencia, recurrencia) se analizará mediante una combinación de análisis de varianza multivariado no paramétrico, de ordenación, correlación matricial, prueba de chi-cuadrado, modelo lineal generalizado o modelos de regresión logística condicional. El rendimiento de los biomarcadores finales se evaluará mediante validación cruzada y se resumirá mediante la puntuación del índice c para evaluar la concordancia entre el modelo y los grupos de comparación mediante curvas ROC. Todas las correcciones de pruebas múltiples se realizarán mediante el cálculo de FDR mediante el método Benjamini Hochenberg, y los valores de p ajustados < 0,05 se considerarán estadísticamente significativos.