食管鳞状细胞癌的微生物组

食管癌对全球癌症负担排名有显着贡献，成为全球癌症相关死亡的第六大原因。 食管鳞状细胞癌 (OESCC) 是全球某些地区最常见的上消化道 (UGI) 癌类型之一，尤其是亚洲的中国和日本。 该病预后极差，总体 5 年生存率低于 30%，主要是由于诊断时已晚期，远处转移的可能性很高。 尽管 OESCC 与吸烟和饮酒等危险因素有关，但对 OESCC 的病因仍知之甚少。

越来越多的证据表明细菌微生物群在致癌作用中起着关键作用。 新出现的数据表明人类微生物组与多种癌症有关，最显着的是结直肠癌中的梭杆菌和胃癌中的螺杆菌。 定殖在胃肠道中的细菌微生物群落分布广泛，并且以复杂的方式相互作用。 微生物组可能与遗传和环境因素相互作用，以代谢膳食成分和异生素等功能。 当微生物平衡被破坏时，微生物群可能会改变宿主细胞的增殖和死亡，操纵免疫系统，影响宿主的新陈代谢，从而引发癌症。 一些研究报道了人类微生物群在上消化道癌中的重要作用，并发现微生物群与上消化道的一些疾病（例如食管炎和 Barrett 食管）以及食管鳞状异型增生和鳞状癌之间存在关联。 另一个鲜为人知的是真菌微生物组在 OESCC 中的作用。

在这里，研究人员将寻求评估细菌和真菌微生物组在 OESCC 中的作用，以及可能在 OESCC 的理解和管理中发挥作用的宿主微生物相互作用。

研究问题：

1. OESCC 和正常患者的微生物组是否不同？
2. 微生物组是否会从正常到癌前病变再到恶性肿瘤？
3. 微生物组和 OESCC 的发展或进展涉及哪些机制？

学习规划：

这是一项前瞻性研究。 该研究将根据赫尔辛基宣言进行。

患者将于 2020 年 6 月至 2025 年 5 月从威尔士亲王医院招募。100 名新诊断为 OESCC 或食管鳞状细胞发育不良的患者将被招募到试验组。 将招募 100 名接受食管胃十二指肠镜检查 (OGD) 且无恶性肿瘤病史的患者加入对照组。 受试者参与的预期持续时间不超过两个月。

研究有两次访问，如下：

1. 访问 1：

   我。就项目进行讨论并签署知情同意书；二. 收集漱口水20ml；三. 完成调查问卷：肠道微生物 - 医疗和健康调查问卷。

2. 访问 2：

有强迫症。 第 2 次就诊将在第 1 次就诊后两个月内进行，并且必须在治疗之前进行。

我。试验组：用肿瘤活检检查病灶，邻近正常组织活检，生理盐水冲洗。

二. 对照组：将对正常组织进行活检并用生理盐水冲洗。

样本大小的理由：

这是一项前瞻性研究，没有基于 OESCC 的先前数据。 但根据头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 的数据以及传统风险因素的一些重叠，研究人员的目标是招募至少 100 名 OESCC 患者和 100 名健康受试者。 在使用 54 个 HNSCC 肿瘤组织和邻近正常组织的 HNSCC 研究中，产生了能够区分病例和对照的 16S rRNA 短读长。 在肿瘤组织中观察到总共 77 个平均相对丰度 > 0.1% 的细菌属。 稀疏分析表明，至少可以从 35 个样本中检测到 73 个属，这表明招募 100 名患者和 100 名对照符合最小化样本量以包含几乎全谱的口腔细菌，预计功效为 0.8 和95% 的置信度来表征病例和对照之间的口腔微生物群失调。

自变量

将检查以下自变量以评估甲基化面板与 OESCC 的关联：

1. 临床因素：疾病的 TNM 分期、合并症；
2. 癌症危险因素：吸烟史、饮酒；
3. 患者因素：性别、年龄；
4. 组织学特征：肿瘤深度、包膜外扩散、淋巴血管浸润、神经周围浸润。

样本：

漱口液：术前进行漱口液，要求所有患者用20ml生理盐水冲洗口腔。 将保留所得溶液用于后续分析。

内窥镜检查程序 内窥镜检查程序将由具备上消化道内窥镜检查专业知识的医生执行。 它将在威尔斯亲王医院的综合内窥镜检查中心进行。 局部麻醉剂将应用于口咽部。 将使用具有放大/双焦点和 NBI 功能的内窥镜。 一个柔软的黑色遮光罩将连接到内窥镜的尖端，以便更好地调节焦距。

然后，测试组中的患者将接受内窥镜检查，对肿瘤进行一次活检，对邻近的正常食管粘膜进行一次活检。 此外，还进行食道冲洗，用20ml生理盐水轻轻冲洗食道，吸出并收集液体用于分析。

对照组患者将按照常规临床实践进行内窥镜检查。 从正常食管粘膜取一份活检用于分析。 同样，将进行食道冲洗。

实验 DNA 提取和亚硫酸氢盐修饰：显微切割的新鲜组织和唾液中的 DNA 将用苯酚-氯仿提取，在 100% 乙醇中沉淀，以 5100 rpm 离心 45 分钟，在 70% 乙醇中洗涤两次，溶解在 LoTE 缓冲液（10mM TRIS盐酸盐，1mM EDTA 缓冲液，pH 8)，并储存在 -80°C。

RNA提取：新鲜组织保存在RNAlater中提取RNA，-80℃保存。

基因组分析：利用下一代测序分析拷贝数畸变和单核苷酸变异来分析使用鸟枪大规模平行测序收集的样本，如前所述。 我们还将使用测序来分析队列的微生物群。 细菌 16S rRNA 基因测序：一份 DNA 将用于使用 16S rRNA 基因 V3-V4 区域扩增子测序 24 筛选口腔微生物群落。 QIIME2 和最新的 Silva 核糖体 RNA 数据库将用于对扩增子序列变异进行分类，操作分类表显示每个样本的细菌读数比例。 菌群 ITS 基因测序：我们将针对菌群内部转录间隔基因 (ITS) 来表征口腔真菌群落。 ITS1 的一个短区域（~270 bp）将使用 MiSeq 进行 PCR 扩增和测序。 读取将针对真菌 UNITE 数据库进行处理，并将在种、属和 OTU 级别生成分类表以进行统计分析。

表达分析：研究人员将使用免疫组织化学染色 (IHC) 和蛋白质阵列的蛋白质分析来确定这些基因组改变的肿瘤是否表达信号蛋白的特定变化。 将收获 FFPE 切片或冷冻组织，用于 IHC 分析或蛋白质分析的基因组特征研究。 对于 IHC 分析或蛋白质分析，总共将使用 5 张 FFPE 幻灯片进行 IHC 或蛋白质提取以进行蛋白质分析，如先前公布的那样。 提取 RNA 并进行 RNA 分析，包括 RNA-seq、表达阵列和 RT-PCR 分析，以确定食管肿瘤的特定基因表达模式，以及潜在生物标志物的表达。

细菌培养：为了进一步了解微生物组作为 OESCC 组织标本中的生物标志物的作用，将培养在测序中鉴定的细菌，以在肿瘤中显着富集。 组织标本用一次性手术刀无菌浸渍并在 PBS (500 μl) 中涡旋 30 秒，然后使用纯悬浮液制备 10 倍 2 ) 稀释液。 将纯悬浮液 (50 μl) 分别涂抹在血琼脂 (BA)、苛养厌氧菌琼脂 (FAA)（BA 和 FAA 中添加了 5% 去纤维蛋白的绵羊血；TCS Biosciences Ltd.）和沙氏琼脂（Lab MTM；International Diagnostics Group上市公司）。 将样本的稀释液和最终 PBS 洗涤液（见上文）涂敷到 BA 和 FAA 上。 BA 和沙氏琼脂平板在 37°C 有氧条件下培养 48 小时。 FAA 板在 36°C 的厌氧柜中孵育 96 小时。

结果措施

1. 将记录从诊断时间到局部、区域或局部和区域复发时间的局部区域无复发生存期。
2. 将从 OESCC 诊断到死亡的时间记录疾病特异性存活率。
3. 将记录从诊断时间到所有原因死亡时间的总生存期。

微生物、手术治疗和个人元数据（例如性别、年龄、吸烟、饮酒、T/N 分期、生存、复发）之间的关联将使用排序、非参数多变量方差分析的组合进行分析，矩阵相关、卡方检验、广义线性模型或条件逻辑回归模型。 最终生物标志物的性能将通过交叉验证进行评估，并通过 c 指数得分进行总结，以使用 ROC 曲线评估模型组和比较组之间的一致性。 所有多重测试校正将通过使用 BenjaminiHochenberg 方法计算 FDR 来执行，调整后的 p 值 < 0.05 将被视为具有统计学意义。