Het microbioom van slokdarmplaveiselcelcarcinoom

Slokdarmcarcinoom draagt ​​aanzienlijk bij aan de wereldwijde ranglijst van kankerlast als de zesde belangrijkste oorzaak van wereldwijde kankergerelateerde sterfte. Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (OESCC) is een van de meest voorkomende typen bovenste gastro-intestinale (UGI) carcinomen in sommige regio's wereldwijd, met name China en Japan in Azië. De ziekte heeft een extreem slechte prognose, met een totale 5-jaarsoverleving van minder dan 30%, voornamelijk vanwege het late stadium bij de diagnose en de hoge waarschijnlijkheid van metastasen op afstand. Hoewel OESCC wordt geassocieerd met risicofactoren zoals roken en alcohol, is de etiologie van OESCC nog steeds slecht begrepen.

Toenemend bewijs wijst op een sleutelrol voor bacteriële microbiota bij carcinogenese. Opkomende gegevens impliceren het menselijke microbioom bij een verscheidenheid aan kankers, met name Fusobacterium bij colorectale kanker en Helicobacter bij maagkanker. Het consortium van bacterieel microbioom dat het maagdarmkanaal koloniseert, is uitgebreid en interageert op een complexe manier. Het microbioom kan interageren met genetische en omgevingsfactoren om onder andere voedingsbestanddelen en xenobiotica te metaboliseren. Wanneer het microbiële evenwicht wordt verstoord, kan de microbiota de proliferatie en dood van gastheercellen veranderen, het immuunsysteem manipuleren en het metabolisme van de gastheer beïnvloeden, waardoor carcinoom ontstaat. Verschillende onderzoeken hebben een belangrijke rol van de menselijke microbiota bij carcinoom van het bovenste deel van het maagdarmkanaal gemeld en associaties gevonden tussen de microbiota en sommige ziekten van het UGI-kanaal, zoals slokdarmontsteking en Barrett-slokdarm, en met plaveiseldysplasie en plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm. Een andere, nog minder bekende, is de rol van het schimmelmicrobioom in OESCC.

Hier zullen de onderzoekers proberen de rol van het bacteriële en schimmelmicrobioom in OESCC en de gastheermicrobe-interacties die een rol kunnen spelen in het begrip en beheer van OESCC te evalueren.

Studievragen:

1. Verschilt het microbioom tussen OESCC en normale patiënten?
2. Verandert het microbioom van normaal via premaligniteit naar maligniteit?
3. Wat zijn de mechanismen die betrokken zijn bij het microbioom en de ontwikkeling of progressie van OESCC?

Studie ontwerp:

Dit is een prospectieve studie. De studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.

Patiënten zouden van juni 2020 tot mei 2025 worden gerekruteerd uit het Prince of Wales Hospital. 100 patiënten met nieuw gediagnosticeerde OESCC of oesofageale plaveiseldysplasie zullen worden gerekruteerd voor de testgroep. 100 patiënten die een oesofagogastroduodenoscopie (OGD) ondergaan zonder een voorgeschiedenis van maligniteit zullen worden gerekruteerd voor de controlegroep. De verwachte duur van deelname van proefpersonen is minder dan twee maanden.

De studie heeft twee bezoeken, namelijk:

1. Bezoek 1:

   i. Om het project te bespreken en het toestemmingsformulier te ondertekenen; ii. Om orale spoeling 20ml op te vangen; iii. Om vragenlijst in te vullen: Gut Microbe - Medische en gezondheidsvragenlijst.

2. Bezoek 2:

OGD hebben. Bezoek 2 wordt binnen twee maanden na bezoek 1 uitgevoerd en moet vóór de behandeling plaatsvinden.

i. Testgroep: met onderzoek van de laesie met biopsie van de tumor, biopsie van aangrenzend normaal weefsel, spoelen met normale zoutoplossing.

ii. Controlegroep: zal een biopsie van normaal weefsel ondergaan en spoelen met normale zoutoplossing.

Rechtvaardiging steekproefomvang:

Dit is een prospectieve studie zonder eerdere gegevens op basis van OESCC. Maar op basis van gegevens van plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek (HNSCC) met enige overlap in traditionele risicofactoren, streven de onderzoekers ernaar om ten minste 100 OESCC-patiënten en 100 gezonde proefpersonen te rekruteren. In HNSCC-onderzoek met behulp van 54 HNSCC-tumorweefsels en de aangrenzende normale weefsels zijn korte 16S rRNA-uitlezingen gegenereerd die in staat zijn gevallen van controles te onderscheiden. Een totaal van 77 bacteriegeslachten met >0,1% gemiddelde relatieve overvloed werd waargenomen in tumorweefsels. Een verdunningsanalyse gaf aan dat ten minste 73 geslachten kunnen worden gedetecteerd uit elk van de 35 monsters, wat suggereert dat rekrutering van 100 patiënten en 100 controles voldoet aan de geminimaliseerde steekproefomvang om bijna het volledige spectrum van orale bacteriën te bevatten en naar verwachting een macht van 0,8 zal hebben en betrouwbaarheidsniveau van 95% om dysbiose van de orale microbiota tussen gevallen en controles te karakteriseren.

Onafhankelijke variabelen

De volgende onafhankelijke variabelen zullen worden onderzocht om de associatie van het methylatiepanel en OESCC te evalueren:

1. Klinische factoren: TNM-stadiëring van ziekte, comorbiditeit;
2. Kankerrisicofactoren: rookgeschiedenis, alcoholgebruik;
3. Patiëntfactoren: geslacht, leeftijd;
4. Histologische kenmerken: tumordiepte, extracapsulaire verspreiding, lymfovasculaire invasie, perineurale invasie.

Monsters:

Orale spoeling: Voorafgaand aan de procedure wordt een orale spoeling uitgevoerd door alle patiënten te vragen de mondholte te spoelen met 20 ml normale zoutoplossing. De resulterende oplossing zou worden bewaard voor latere analyse.

Endoscopische procedures Endoscopische procedures zouden worden uitgevoerd door artsen met expertise in het uitvoeren van bovenste endoscopie. Het zou worden uitgevoerd in het gecombineerde endoscopiecentrum, Prince of Wales Hospital. Topische plaatselijke verdoving zal worden toegepast op de orofarynx. Er zouden endoscopen met vergroting/dubbele focus en NBI-functie worden gebruikt. Een zachte zwarte kap zou aan de punt van de endoscoop worden bevestigd voor een betere aanpassing van de brandpuntsafstand.

Patiënten in de testgroep zouden dan een endoscopie ondergaan met één biopsie van de tumor en één biopsie van het aangrenzende normale slokdarmslijmvlies. Bovendien zou slokdarmspoeling ook worden uitgevoerd door de slokdarm voorzichtig te spoelen met 20 ml normale zoutoplossing en de vloeistof wordt afgezogen en verzameld voor analyse.

Patiënten in de controlegroep zouden een endoscopie ondergaan volgens de gebruikelijke klinische praktijk. Er zou één biopsie worden genomen van normaal slokdarmslijmvlies voor analyse. Evenzo zou slokdarmspoeling worden uitgevoerd.

Experimenten DNA-extractie en bisulfietmodificatie: DNA uit gemicrodissecteerde verse weefsels en speeksel wordt geëxtraheerd met fenol-chloroform, geprecipiteerd in 100% ethanol, 45 minuten gecentrifugeerd bij 5100 rpm, tweemaal gewassen in 70% ethanol, opgelost in LoTE-buffer (10 mM TRIS hydrochloride, 1 mM EDTA-buffer, pH 8), en bewaard bij -80°C.

RNA-extractie: Vers weefsel wordt opgeslagen in RNAlater voor extractie van RNA en bewaard bij -80°C.

Genomische analyse: gebruikmakend van sequentiëringsanalyse van de volgende generatie voor aberraties van het aantal kopieën en variaties van enkele nucleotiden om de verzamelde monsters te analyseren met behulp van massale parallelle sequentiëring met shotgun, zoals eerder beschreven. We zullen ook sequencing gebruiken om de microbiota van het cohort te analyseren. Bacteriële 16S rRNA-gensequencing: een deel van het DNA zal worden gebruikt om de orale microbiële gemeenschap te screenen met behulp van 16S rRNA-gen V3-V4-regio ampliconsequencing 24. QIIME2 met de nieuwste Silva ribosomale RNA-database zal worden gebruikt om de ampliconsequentievariant te classificeren, met een operationele taxonomische tabel die het aandeel bacteriële metingen per monster weergeeft. Mycobiota ITS-gensequencing: we zullen mycobiota internal getranscribeerd spacer-gen (ITS) targeten om de orale schimmelgemeenschap te karakteriseren. Een kort gebied van ITS1 (~270 bp) zal PCR worden geamplificeerd en gesequenced met behulp van MiSeq. De reads zullen worden verwerkt tegen een schimmel UNITE-database en de classificatietabellen zullen worden gegenereerd op soort-, genera- en OTU-niveau voor statistische analyses.

Expressie-analyse: de onderzoekers zullen bepalen of deze genomisch veranderde tumoren specifieke veranderingen in signaaleiwitten tot expressie brengen met behulp van immunohistochemische kleuring (IHC) en eiwitprofilering door eiwitarrays. FFPE-secties of ingevroren weefsels zullen worden geoogst voor naast genomisch karakteriseringsonderzoek voor IHC-analyses of eiwitprofilering. Voor IHC-analyse of eiwitprofilering zullen in totaal 5 FFPE-dia's worden gebruikt voor IHC of eiwitextractie voor eiwitprofilering, zoals eerder gepubliceerd. RNA zal worden geëxtraheerd en onderworpen aan RNA-analyses, waaronder RNA-seq, expression array en RT-PCR-analyses om specifieke genexpressiepatronen van slokdarmtumoren te bepalen, evenals expressie van potentiële biomarkers.

Bacteriële kweek: om de rol van het microbioom als biomarker in OESCC beter te begrijpen, zullen weefselspecimens worden gekweekt voor bacteriën die bij sequencing zijn geïdentificeerd als significant verrijkt in tumoren. Weefselspecimens werden aseptisch gemacereerd met wegwerpbare scalpels en gedurende 30 seconden gevortext in PBS (500 1), en de zuivere suspensies werden gebruikt om 10-voudige 2) verdunningen te maken. Zuivere suspensies (50 l) werden elk verspreid op bloedagar (BA), kieskeurige anaerobe agar (FAA) (BA en FAA aangevuld met 5% gedefibrineerd schapenbloed; TCS Biosciences Ltd.) en Sabouraud's agar (Lab MTM; International Diagnostics Group bv.). De verdunningen en uiteindelijke PBS-wassingen van de monsters (zie hierboven) werden uitgesmeerd op BA en FAA. De agarplaten van BA en Sabouraud werden 48 uur aëroob bij 37°C geïncubeerd. FAA-platen werden 96 uur bij 36°C in een anaerobe kast geïncubeerd.

Uitkomst maatregelen

1. Locoregionale recidiefvrije overleving zal worden geregistreerd vanaf het moment van diagnose tot het moment van recidief lokaal, regionaal of lokaal en regionaal.
2. Ziektespecifieke overleving zal worden geregistreerd vanaf het moment van diagnose tot het moment van overlijden van OESCC.
3. De algehele overleving zal worden geregistreerd vanaf het moment van diagnose tot het moment van overlijden door alle oorzaken.

Statistische analyse Associatie tussen microben, chirurgische behandeling en metadata van individuen (bijv. geslacht, leeftijd, roken, drinken, T/N-stadia, overleving, recidief) zal worden geanalyseerd met behulp van een mix van ordinatie, niet-parametrische multivariate variantieanalyse, matrixcorrelatie, chikwadraattoets, gegeneraliseerd lineair model of conditionele logistische regressiemodellen. De prestaties van de uiteindelijke biomarkers zullen worden beoordeeld door middel van kruisvalidatie en worden samengevat door middel van de c-indexscore om de concordantie tussen model- en vergelijkingsgroepen te beoordelen met behulp van ROC-curven. Alle meervoudige testcorrecties worden uitgevoerd door FDR's te berekenen met behulp van de BenjaminiHochenberg-methode, en aangepaste p-waarden < 0,05 worden als statistisch significant beschouwd.