Das Mikrobiom des Ösophagus-Plattenepithelkarzinoms

Das Ösophaguskarzinom trägt erheblich zur weltweiten Krebslast bei und ist die sechsthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit. Ösophagus-Plattenepithelkarzinom (OESCC) ist eine der häufigsten Arten von Karzinomen des oberen Gastrointestinaltrakts (UGI) in einigen Regionen weltweit, insbesondere in China und Japan in Asien. Die Krankheit hat eine extrem schlechte Prognose mit 5-Jahres-Gesamtüberlebensraten von weniger als 30 %, hauptsächlich aufgrund des späten Diagnosestadiums und der hohen Wahrscheinlichkeit von Fernmetastasen. Obwohl OESCC mit Risikofaktoren wie Rauchen und Alkohol assoziiert ist, ist die Ätiologie von OESCC noch wenig verstanden.

Zunehmende Beweise weisen auf eine Schlüsselrolle der bakteriellen Mikrobiota bei der Karzinogenese hin. Neue Daten deuten darauf hin, dass das menschliche Mikrobiom mit einer Vielzahl von Krebsarten in Verbindung gebracht wird, insbesondere mit Fusobacterium bei Darmkrebs und Helicobacter bei Magenkrebs. Das Konsortium bakterieller Mikrobiome, die den Magen-Darm-Trakt besiedeln, ist umfangreich und interagiert auf komplexe Weise. Das Mikrobiom kann mit genetischen und Umweltfaktoren interagieren, um unter anderem Nahrungsbestandteile und Xenobiotika zu metabolisieren. Wenn das mikrobielle Gleichgewicht gestört ist, könnte die Mikrobiota die Proliferation und den Tod von Wirtszellen verändern, das Immunsystem manipulieren und den Stoffwechsel des Wirts beeinflussen, was zu Karzinomen führen würde. Mehrere Studien haben über eine wichtige Rolle der menschlichen Mikrobiota beim Karzinom des oberen Gastrointestinaltrakts berichtet und Assoziationen zwischen der Mikrobiota und einigen Erkrankungen des UGI-Trakts wie Ösophagitis und Barrett-Ösophagus sowie mit Plattenepithel-Dysplasie und Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre gefunden. Noch weniger bekannt ist die Rolle des Pilzmikrobioms bei OESCC.

Hier werden die Forscher versuchen, die Rolle des bakteriellen und pilzlichen Mikrobioms bei OESCC und die Wechselwirkungen der Wirtsmikroben zu bewerten, die beim Verständnis und Management von OESCC eine Rolle spielen können.

Studienfragen:

1. Unterscheidet sich das Mikrobiom zwischen OESCC und normalen Patienten?
2. Verändert sich das Mikrobiom von normal über Prämaligne zu Malignität?
3. Welche Mechanismen sind am Mikrobiom und der Entwicklung oder Progression von OESCC beteiligt?

Studiendesign:

Dies ist eine prospektive Studie. Die Studie wird gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Die Patienten würden vom Prince of Wales Hospital von Juni 2020 bis Mai 2025 rekrutiert. 100 Patienten mit neu diagnostiziertem OESCC oder ösophagealer Plattenepitheldysplasie werden in die Testgruppe rekrutiert. 100 Patienten, die sich einer Ösophagogastroduodenoskopie (OGD) ohne maligne Vorgeschichte unterziehen, werden in die Kontrollgruppe rekrutiert. Die voraussichtliche Dauer der Studienteilnahme beträgt weniger als zwei Monate.

Die Studie hat zwei Besuche, wie folgt:

1. Besuch 1:

   ich. Um über das Projekt zu diskutieren und die Einwilligungserklärung zu unterzeichnen; ii. Zum Sammeln von Mundspülung 20ml; iii. Zum Ausfüllen des Fragebogens: Darm Microbe - Medizinischer und gesundheitlicher Fragebogen.

2. Besuch 2:

OGD haben. Visite 2 wird innerhalb von zwei Monaten nach Visite 1 durchgeführt und muss vor der Behandlung durchgeführt werden.

ich. Testgruppe: Mit Untersuchung der Läsion mit Biopsie des Tumors, Biopsie des angrenzenden normalen Gewebes, Spülung mit physiologischer Kochsalzlösung.

ii. Kontrollgruppe: Wird eine Biopsie von normalem Gewebe haben und mit normaler Kochsalzlösung gespült.

Begründung der Stichprobengröße:

Dies ist eine prospektive Studie ohne vorherige Daten basierend auf OESCC. Aber basierend auf Daten zum Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) mit einigen Überschneidungen bei traditionellen Risikofaktoren zielen die Forscher darauf ab, mindestens 100 OESCC-Patienten und 100 gesunde Probanden zu rekrutieren. In einer HNSCC-Studie mit 54 HNSCC-Tumorgeweben und den angrenzenden normalen Geweben wurden kurze 16S-rRNA-Lesevorgänge generiert, die in der Lage waren, Fälle von Kontrollen zu unterscheiden. In Tumorgeweben wurden insgesamt 77 Bakteriengattungen mit einer mittleren relativen Häufigkeit von >0,1 % beobachtet. Eine Verdünnungsanalyse zeigte, dass mindestens 73 Gattungen aus jeder der 35 Proben nachgewiesen werden können, was darauf hindeutet, dass die Rekrutierung von 100 Patienten und 100 Kontrollen die minimierte Probengröße erfüllt, um nahezu das gesamte Spektrum oraler Bakterien zu enthalten, und eine Stärke von 0,8 erwartet wird Konfidenzniveau von 95 % zur Charakterisierung einer oralen Mikrobiota-Dysbiose zwischen Fällen und Kontrollen.

Unabhängige Variablen

Die folgenden unabhängigen Variablen werden untersucht, um die Assoziation des Methylierungspanels und des OESCC zu bewerten:

1. Klinische Faktoren: TNM-Staging der Erkrankung, Komorbiditäten;
2. Krebsrisikofaktoren: Rauchergeschichte, Alkoholkonsum;
3. Patientenfaktoren: Geschlecht, Alter;
4. Histologische Merkmale: Tumortiefe, extrakapsuläre Ausbreitung, lymphovaskuläre Invasion, perineurale Invasion.

Proben:

Mundspülung: Vor dem Eingriff wird eine Mundspülung durchgeführt, indem alle Patienten gebeten werden, die Mundhöhle mit 20 ml normaler Kochsalzlösung zu spülen. Die resultierende Lösung würde für eine spätere Analyse aufbewahrt.

Endoskopische Eingriffe Endoskopische Eingriffe werden von Ärzten mit Erfahrung in der Durchführung der oberen Endoskopie durchgeführt. Sie würde im Combined Endoscopy Center des Prince of Wales Hospital durchgeführt. Lokales Lokalanästhetikum wird auf den Oropharynx aufgetragen. Es würden Endoskope mit Vergrößerung/Doppelfokus und NBI-Funktion verwendet. An der Spitze des Endoskops würde zur besseren Einstellung der Brennweite eine weiche schwarze Haube angebracht.

Patienten in der Testgruppe würden sich dann einer Endoskopie mit einer Biopsie des Tumors und einer Biopsie der angrenzenden normalen Ösophagusschleimhaut unterziehen. Zusätzlich würde auch eine Ösophagusspülung durchgeführt, indem die Speiseröhre vorsichtig mit 20 ml normaler Kochsalzlösung gespült und die Flüssigkeit abgesaugt und zur Analyse gesammelt wird.

Patienten in der Kontrollgruppe würden sich einer Endoskopie gemäß der üblichen klinischen Praxis unterziehen. Eine Biopsie würde aus normaler Ösophagusschleimhaut zur Analyse entnommen werden. In ähnlicher Weise würde eine Speiseröhrenspülung durchgeführt werden.

Experimente DNA-Extraktion und Bisulfit-Modifikation: DNA aus mikrosezierten frischen Geweben und Speichel wird mit Phenol-Chloroform extrahiert, in 100 % Ethanol ausgefällt, bei 5100 U/min für 45 Minuten zentrifugiert, zweimal in 70 % Ethanol gewaschen, in LoTE-Puffer (10 mM TRIS Hydrochlorid, 1 mM EDTA-Puffer, pH 8) und bei –80°C gelagert.

RNA-Extraktion: Frisches Gewebe wird zur Extraktion von RNA in RNAlater gelagert und bei -80 °C gelagert.

Genomische Analyse: Verwendung der Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation für Kopienzahlaberrationen und einzelne Nukleotidvariationen, um die Proben zu analysieren, die unter Verwendung von Shotgun Massive Parallel Sequencing, wie zuvor beschrieben, gesammelt wurden. Wir werden auch die Sequenzierung verwenden, um die Mikrobiota der Kohorte zu analysieren. Bakterielle 16S-rRNA-Gensequenzierung: Ein DNA-Aliquot wird verwendet, um die orale mikrobielle Gemeinschaft mithilfe der Amplikonsequenzierung der V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens zu screenen 24. QIIME2 mit der neuesten ribosomalen RNA-Datenbank von Silva wird zur Klassifizierung von Amplikon-Sequenzvarianten verwendet, wobei die operationale taxonomische Tabelle den Anteil der bakteriellen Reads pro Probe zeigt. Mycobiota ITS-Gensequenzierung: Wir werden das interne transkribierte Spacer-Gen (ITS) von Mycobiota anvisieren, um die orale Pilzgemeinschaft zu charakterisieren. Eine kurze Region von ITS1 (~270 bp) wird PCR-amplifiziert und mit MiSeq sequenziert. Die Reads werden gegen eine pilzliche UNITE-Datenbank verarbeitet, und die Klassifizierungstabellen werden auf Art-, Gattungs- und OTU-Ebene für statistische Analysen generiert.

Expressionsanalyse: Die Forscher werden feststellen, ob diese genomisch veränderten Tumore spezifische Veränderungen in Signalproteinen exprimieren, indem sie immunhistochemische Färbung (IHC) und Proteinprofilierung durch Protein-Arrays verwenden. FFPE-Schnitte oder gefrorene Gewebe werden zusammen mit genomischen Charakterisierungsstudien für IHC-Analysen oder Proteinprofilierung geerntet. Für die IHC-Analyse oder das Proteinprofiling werden insgesamt 5 FFPE-Objektträger für die IHC- oder Proteinextraktion für das Proteinprofiling eingesetzt, wie zuvor veröffentlicht. RNA wird extrahiert und RNA-Analysen unterzogen, einschließlich RNA-seq, Expressions-Array und RT-PCR-Analysen, um spezifische Genexpressionsmuster von Ösophagustumoren sowie die Expression potenzieller Biomarker zu bestimmen.

Bakterienkultur: Um die Rolle des Mikrobioms als Biomarker in OESCC-Gewebeproben besser zu verstehen, werden Gewebeproben für Bakterien kultiviert, die bei der Sequenzierung identifiziert wurden, um in Tumoren signifikant angereichert zu werden. Gewebeproben wurden aseptisch mit Einwegskalpellen mazeriert und für 30 Sekunden in PBS (500 l) gevortext, und die unverdünnten Suspensionen wurden verwendet, um 10-fache 2 ) Verdünnungen herzustellen. Reine Suspensionen (50 l) wurden jeweils auf Blutagar (BA), anspruchsvollem anaeroben Agar (FAA) (BA und FAA ergänzt mit 5 % defibriniertem Schafblut; TCS Biosciences Ltd.) und Sabouraud-Agar (Lab MTM; International Diagnostics Group AG). Die Verdünnungen und abschließenden PBS-Waschungen der Proben (siehe oben) wurden auf BA und FAA verteilt. BA- und Sabouraud-Agarplatten wurden aerob bei 37°C für 48 h inkubiert. FAA-Platten wurden in einem anaeroben Schrank bei 36°C für 96 h inkubiert.

Ergebnismaßnahmen

1. Das lokoregionäre rezidivfreie Überleben wird vom Zeitpunkt der Diagnose bis zum Zeitpunkt des Rezidivs lokal, regional oder lokal und regional aufgezeichnet.
2. Das krankheitsspezifische Überleben wird vom Zeitpunkt der Diagnose bis zum Todeszeitpunkt von OESCC aufgezeichnet.
3. Das Gesamtüberleben wird vom Zeitpunkt der Diagnose bis zum Zeitpunkt des Todes aller Ursachen aufgezeichnet.

Statistische Analyse Der Zusammenhang zwischen Mikroben, chirurgischer Behandlung und individuellen Metadaten (z. B. Geschlecht, Alter, Rauchen, Trinken, T/N-Stadien, Überleben, Rezidiv) wird mit einer Mischung aus Ordination, nichtparametrischer multivariater Varianzanalyse, Matrixkorrelation, Chi-Quadrat-Test, verallgemeinertes lineares Modell oder bedingte logistische Regressionsmodelle. Die Leistung der endgültigen Biomarker wird durch Kreuzvalidierung bewertet und anhand des c-Index-Scores zusammengefasst, um die Übereinstimmung zwischen Modell- und Vergleichsgruppen anhand von ROC-Kurven zu bewerten. Alle mehrfachen Testkorrekturen werden durch Berechnung der FDRs nach der BenjaminiHochenberg-Methode durchgeführt, und angepasste p-Werte < 0,05 werden als statistisch signifikant angesehen.