O microbioma do carcinoma de células escamosas do esôfago

O carcinoma esofágico contribui significativamente para o ranking global da carga de câncer como a sexta principal causa de morte global relacionada ao câncer. O carcinoma esofágico de células escamosas (OESCC) é um dos tipos mais comuns de carcinoma gastrointestinal superior (UGI) em algumas regiões do mundo, particularmente China e Japão na Ásia. A doença tem um prognóstico extremamente ruim, com taxas de sobrevida global em 5 anos inferiores a 30%, principalmente devido ao estágio tardio no diagnóstico e alta probabilidade de metástases à distância. Embora o OESCC esteja associado a fatores de risco, incluindo tabagismo e álcool, a etiologia do OESCC ainda é pouco compreendida.

Evidências crescentes indicam um papel fundamental para a microbiota bacteriana na carcinogênese. Dados emergentes implicam o microbioma humano em uma variedade de cânceres, principalmente Fusobacterium no câncer colorretal e Helicobacter no câncer gástrico. O consórcio de microbioma bacteriano que coloniza o trato gastrointestinal é extenso e interage de maneira complexa. O microbioma pode interagir com fatores genéticos e ambientais para metabolizar constituintes dietéticos e xenobióticos, entre outras funções. Quando o equilíbrio microbiano é perturbado, a microbiota pode alterar a proliferação e morte das células hospedeiras, manipular o sistema imunológico e influenciar o metabolismo do hospedeiro, dando origem ao carcinoma. Vários estudos relataram um papel importante da microbiota humana no carcinoma gastrointestinal superior e encontraram associações entre a microbiota e algumas doenças do trato UGI, como esofagite e esôfago de Barrett, e com displasia escamosa e carcinoma escamoso do esôfago. Outro ainda menos conhecido é o papel do microbioma fúngico na OESCC.

Aqui, os investigadores procurarão avaliar o papel do microbioma bacteriano e fúngico no OESCC e as interações do micróbio hospedeiro que podem desempenhar um papel na compreensão e gestão do OESCC.

Questões de estudo:

1. O microbioma difere entre OESCC e pacientes normais?
2. O microbioma muda de normal para pré-malignidade para malignidade?
3. Quais são os mecanismos envolvidos no microbioma e no desenvolvimento ou progressão da OESCC?

Design de estudo:

Este é um estudo prospectivo. O estudo será realizado de acordo com a Declaração de Helsinki.

Os pacientes seriam recrutados no Hospital Prince of Wales de junho de 2020 a maio de 2025. 100 pacientes com OESCC recém-diagnosticado ou displasia escamosa esofágica serão recrutados para o grupo de teste. 100 pacientes submetidos a uma esofagogastroduodenoscopia (OGD) sem história de malignidade serão recrutados para o grupo controle. A duração esperada da participação do sujeito é inferior a dois meses.

O estudo tem duas visitas, como segue:

1. Visita 1:

   eu. Discutir sobre o projeto e assinar o termo de consentimento informado; ii. Para coletar enxaguatório bucal 20ml; iii. Para preencher o questionário: Gut Microbe - Questionário médico e de saúde.

2. Visita 2:

Ter OGD. A visita 2 será realizada dentro de dois meses após a visita 1 e deve ser realizada antes do tratamento.

eu. Grupo de teste: Com exame da lesão com biópsia do tumor, biópsia do tecido normal adjacente, lavagem com solução salina normal.

ii. Grupo de controle: fará uma biópsia de tecido normal e lavará com solução salina normal.

Justificativa do tamanho da amostra:

Este é um estudo prospectivo sem dados anteriores baseados em OESCC. Mas com base em dados de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) com alguma sobreposição em fatores de risco tradicionais, os investigadores pretendem recrutar pelo menos 100 pacientes com OESCC e 100 indivíduos saudáveis. No estudo HNSCC usando 54 tecidos tumorais HNSCC e os tecidos normais adjacentes, gerou leituras curtas de 16S rRNA capazes de discriminar casos de controles. Um total de 77 gêneros bacterianos com abundância relativa média > 0,1% foi observado em tecidos tumorais. Uma análise de rarefação indicou que pelo menos 73 gêneros podem ser detectados em qualquer uma das 35 amostras, sugerindo que o recrutamento de 100 pacientes e 100 controles atende ao tamanho de amostra minimizado para conter quase todo o espectro de bactérias orais e espera-se que tenha um poder de 0,8 e nível de confiança de 95% para caracterizar a disbiose da microbiota oral entre casos e controles.

Variáveis ​​independentes

As seguintes variáveis ​​independentes serão examinadas para avaliar a associação do painel de metilação e OESCC:

1. Fatores clínicos: estadiamento TNM da doença, comorbidades;
2. Fatores de risco para câncer: histórico de tabagismo, consumo de álcool;
3. Fatores do paciente: sexo, idade;
4. Características histológicas: profundidade do tumor, disseminação extracapsular, invasão linfovascular, invasão perineural.

Amostras:

Enxágue oral: Antes do procedimento, seria realizado um enxágue oral, solicitando a todos os pacientes que enxaguassem a cavidade oral com 20 ml de solução salina normal. A solução resultante seria mantida para posterior análise.

Procedimentos endoscópicos Os procedimentos endoscópicos seriam realizados por médicos com experiência na realização de endoscopia digestiva alta. Seria realizado no Centro de Endoscopia Combinada, Hospital Prince of Wales. Anestésico local tópico será aplicado na orofaringe. Endoscópios com ampliação/foco duplo e função NBI seriam usados. Um capuz preto macio seria anexado à ponta do endoscópio para melhor ajuste da distância focal.

Os pacientes do grupo de teste seriam então submetidos a endoscopia com uma biópsia do tumor e uma biópsia da mucosa esofágica normal adjacente. Além disso, a lavagem esofágica também seria realizada lavando o esôfago suavemente com 20 ml de solução salina normal e o fluido aspirado e coletado para análise.

Os pacientes do grupo controle seriam submetidos à endoscopia de acordo com a prática clínica usual. Uma biópsia seria retirada da mucosa esofágica normal para análise. Da mesma forma, a lavagem esofágica seria realizada.

Experimentos Extração de DNA e modificação de bissulfito: DNA de tecidos frescos microdissecados e saliva serão extraídos com fenol-clorofórmio, precipitados em etanol 100%, centrifugados a 5100 rpm por 45 minutos, lavados em etanol 70% duas vezes, dissolvidos em tampão LoTE (10mM TRIS cloridrato, tampão EDTA 1 mM, pH 8) e armazenado a -80°C.

Extração de RNA: O tecido fresco será armazenado em RNA posteriormente para extração de RNA e armazenado a -80°C.

Análise genômica: Utilizando análise de sequenciamento de próxima geração para aberrações de número de cópias e variações de nucleotídeo único para analisar as amostras coletadas usando sequenciamento paralelo massivo de espingarda, conforme descrito anteriormente. Também usaremos o sequenciamento para analisar a microbiota da coorte. Sequenciamento do gene 16S rRNA bacteriano: Uma alíquota de DNA será usada para rastrear a comunidade microbiana oral usando o sequenciamento do amplicon da região V3- V4 do gene 16S rRNA 24. O QIIME2 com o último banco de dados de RNA ribossômico Silva será usado para classificar a variante da sequência amplicon, com tabela taxonômica operacional mostrando a proporção de leituras bacterianas por amostra. Sequenciamento do gene ITS da micobiota: teremos como alvo o gene espaçador transcrito interno (ITS) da micobiota para caracterizar a comunidade fúngica oral. Uma pequena região de ITS1 (~270 pb) será amplificada por PCR e sequenciada usando MiSeq. As leituras serão processadas contra um banco de dados UNITE fúngico, e as tabelas de classificação serão geradas em nível de espécie, gênero e OTU para análises estatísticas.

Análise de expressão: Os investigadores determinarão se esses tumores genomicamente alterados expressam alterações específicas nas proteínas de sinalização usando coloração imuno-histoquímica (IHC) e perfis de proteínas por matrizes de proteínas. Seções FFPE ou tecidos congelados serão colhidos juntamente com estudo de caracterização genômica para análises de IHC ou perfil de proteína. Para análise de IHC ou perfil de proteína, um total de 5 lâminas FFPE será empregado para IHC ou extração de proteína para perfil de proteína, conforme publicado anteriormente. O RNA será extraído e submetido a análises de RNA, incluindo RNA-seq, array de expressão e análises de RT-PCR para determinar padrões de expressão gênica específicos de tumores esofágicos, bem como a expressão de potenciais biomarcadores.

Cultura bacteriana: Para entender melhor o papel do microbioma como um biomarcador em amostras de tecido OESCC, serão cultivadas bactérias identificadas no sequenciamento para serem significativamente enriquecidas em tumores. Espécimes de tecido foram macerados assepticamente com bisturis descartáveis ​​e agitados em vórtex por 30 segundos em PBS (500 l), e as suspensões puras foram usadas para fazer diluições de 10 vezes 2 ). Suspensões puras (50 l) foram espalhadas em ágar sangue (BA), ágar anaeróbio exigente (FAA) (BA e FAA suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado; TCS Biosciences Ltd.) e ágar Sabouraud (Lab MTM; International Diagnostics Group plc). As diluições e lavagens finais com PBS das amostras (ver acima) foram espalhadas em BA e FAA. As placas de ágar BA e Sabouraud foram incubadas aerobiamente a 37°C por 48 h. As placas de FAA foram incubadas em um gabinete anaeróbico a 36°C por 96 h.

Medidas de resultados

1. A sobrevida livre de recorrência locorregional será registrada desde o momento do diagnóstico até o momento da recorrência local, regional ou local e regional.
2. A sobrevida específica da doença será registrada desde o momento do diagnóstico até o momento da morte por OESCC.
3. A sobrevida global será registrada desde o momento do diagnóstico até o momento da morte por todas as causas.

Análise estatística A associação entre micróbios, tratamento cirúrgico e metadados dos indivíduos (por exemplo, sexo, idade, tabagismo, consumo de álcool, estágios T/N, sobrevivência, recorrência) será analisada usando uma mistura de ordenação, análise multivariada não paramétrica de variância, correlação matricial, teste qui-quadrado, modelo linear generalizado ou modelos de regressão logística condicional. O desempenho dos biomarcadores finais será avaliado por validação cruzada e resumido pela pontuação c-index para avaliar a concordância entre o modelo e os grupos de comparação usando curvas ROC. Todas as correções de testes múltiplos serão realizadas pelo cálculo de FDRs usando o método BenjaminiHochenberg, e valores ajustados de p < 0,05 serão considerados estatisticamente significativos.