Микробиом плоскоклеточного рака пищевода

Карцинома пищевода вносит значительный вклад в глобальное бремя рака, занимая шестое место среди основных причин смерти от рака в мире. Плоскоклеточный рак пищевода (OESCC) является одним из наиболее распространенных типов рака верхних отделов желудочно-кишечного тракта (UGI) в некоторых регионах мира, особенно в Китае и Японии в Азии. Заболевание имеет чрезвычайно плохой прогноз, с общей 5-летней выживаемостью менее 30%, в основном из-за поздней стадии диагностики и высокой вероятности отдаленных метастазов. Хотя OESCC связан с факторами риска, включая курение и употребление алкоголя, этиология OESCC до сих пор плохо изучена.

Все больше данных указывает на ключевую роль бактериальной микробиоты в канцерогенезе. Новые данные указывают на то, что микробиом человека связан с различными видами рака, в первую очередь с Fusobacterium при колоректальном раке и Helicobacter при раке желудка. Консорциум бактериального микробиома, колонизирующего желудочно-кишечный тракт, обширен и взаимодействует сложным образом. Микробиом может взаимодействовать с генетическими факторами и факторами окружающей среды для метаболизма пищевых компонентов и ксенобиотиков, помимо других функций. Когда микробный баланс нарушается, микробиота может изменять пролиферацию и гибель клеток-хозяев, манипулировать иммунной системой и влиять на метаболизм хозяина, вызывая рак. В нескольких исследованиях сообщалось о важной роли микробиоты человека при карциноме верхних отделов желудочно-кишечного тракта и были обнаружены ассоциации между микробиотой и некоторыми заболеваниями желудочно-кишечного тракта, такими как эзофагит и пищевод Барретта, а также с плоскоклеточной дисплазией и плоскоклеточным раком пищевода. Еще менее известна роль грибкового микробиома в OESCC.

Здесь исследователи будут стремиться оценить роль бактериального и грибкового микробиома в OESCC и взаимодействия микробов-хозяев, которые могут играть роль в понимании и лечении OESCC.

Учебные вопросы:

1. Отличается ли микробиом пациентов с OESCC и нормальных пациентов?
2. Изменяется ли микробиом от нормального до злокачественного?
3. Какие механизмы вовлечены в микробиом и развитие или прогрессирование OESCC?

Дизайн исследования:

Это проспективное исследование. Исследование будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Пациенты будут набираться из больницы принца Уэльского с июня 2020 года по май 2025 года. В тестовую группу будут набраны 100 пациентов с недавно диагностированным OESCC или плоскоклеточной дисплазией пищевода. В контрольную группу войдут 100 пациентов, прошедших эзофагогастродуоденоскопию (ОГД) без злокачественных новообразований в анамнезе. Ожидаемая продолжительность участия субъекта составляет менее двух месяцев.

Исследование состоит из двух посещений, а именно:

1. Посещение 1:

   я. Обсудить проект и подписать форму информированного согласия; II. Для сбора полоскания рта 20мл; III. Заполнить анкету: Микроб кишечника - Медицинская и медицинская анкета.

2. Визит 2:

Иметь ОГД. Визит 2 будет проведен в течение двух месяцев после визита 1 и должен быть проведен до начала лечения.

я. Тестовая группа: с исследованием очага с биопсией опухоли, биопсией прилегающих нормальных тканей, промыванием физиологическим раствором.

II. Контрольная группа: биопсия нормальной ткани и промывание физиологическим раствором.

Обоснование размера выборки:

Это проспективное исследование без предыдущих данных, основанное на OESCC. Но, основываясь на данных о плоскоклеточном раке головы и шеи (HNSCC) с некоторым совпадением традиционных факторов риска, исследователи планируют набрать не менее 100 пациентов с OESCC и 100 здоровых субъектов. В исследовании HNSCC с использованием 54 опухолевых тканей HNSCC и прилегающих нормальных тканей были получены короткие чтения 16S рРНК, способные отличить случаи от контроля. Всего в опухолевых тканях наблюдали 77 родов бактерий со средней относительной численностью >0,1%. Анализ разрежения показал, что по крайней мере 73 рода могут быть обнаружены в любом из 35 образцов, предполагая, что набор 100 пациентов и 100 контролей соответствует минимальному размеру выборки, чтобы содержать почти полный спектр бактерий полости рта, и, как ожидается, будет иметь степень 0,8 и уровень достоверности 95% для характеристики дисбактериоза микробиоты полости рта между случаями и контролем.

Независимые переменные

Следующие независимые переменные будут исследованы для оценки ассоциации панели метилирования и OESCC:

1. Клинические факторы: стадия заболевания по TNM, сопутствующие заболевания;
2. Факторы риска рака: курение в анамнезе, употребление алкоголя;
3. Факторы пациента: пол, возраст;
4. Гистологические характеристики: глубина опухоли, экстракапсулярное распространение, лимфоваскулярная инвазия, периневральная инвазия.

Образцы:

Полоскание полости рта: перед процедурой будет проведено полоскание полости рта, попросив всех пациентов прополоскать ротовую полость 20 мл физиологического раствора. Полученный раствор будет сохранен для последующего анализа.

Эндоскопические процедуры Эндоскопические процедуры будут выполняться врачами, имеющими опыт проведения эндоскопии верхних отделов. Его будут проводить в Центре комбинированной эндоскопии больницы принца Уэльского. На ротоглотку наносится местный анестетик местного действия. Будут использоваться эндоскопы с увеличением/двойным фокусом и функцией NBI. К кончику эндоскопа прикрепляли мягкий черный колпак для лучшей регулировки фокусного расстояния.

Затем пациенты в тестовой группе подвергались эндоскопии с одной биопсией опухоли и одной биопсией прилегающей нормальной слизистой оболочки пищевода. Кроме того, следует также провести полоскание пищевода путем осторожного промывания пищевода 20 мл физиологического раствора, а жидкость отсасывают и собирают для анализа.

Пациентам контрольной группы проводилась эндоскопия в соответствии с обычной клинической практикой. Одна биопсия будет взята из нормальной слизистой оболочки пищевода для анализа. Аналогичным образом проводят промывание пищевода.

Эксперименты Экстракция ДНК и бисульфитная модификация: ДНК из микродиссекции свежих тканей и слюны экстрагируют фенол-хлороформом, осаждают в 100% этаноле, центрифугируют при 5100 об/мин в течение 45 минут, дважды промывают в 70% этаноле, растворяют в буфере LoTE (10 мМ ТРИС). гидрохлорид, 1 мМ буфер ЭДТА, рН 8) и хранили при -80°С.

Экстракция РНК: Свежая ткань будет храниться в RNAlater для экстракции РНК и храниться при температуре -80°C.

Геномный анализ: использование анализа секвенирования нового поколения для выявления аберраций числа копий и вариаций отдельных нуклеотидов для анализа образцов, собранных с использованием массового параллельного секвенирования дробовика, как описано ранее. Мы также будем использовать секвенирование для анализа микробиоты когорты. Секвенирование бактериального гена 16S рРНК: аликвоту ДНК будет использовать для скрининга микробного сообщества полости рта с использованием секвенирования ампликона области V3-V4 гена 16S рРНК 24. QIIME2 с последней базой данных рибосомной РНК Silva будет использоваться для классификации варианта последовательности ампликона с рабочей таксономической таблицей, показывающей долю бактериальных прочтений на образец. Секвенирование гена ITS микобиоты: мы нацелимся на внутренний транскрибируемый спейсерный ген (ITS) микобиоты, чтобы охарактеризовать грибковое сообщество полости рта. Короткая область ITS1 (~ 270 п.н.) будет амплифицирована методом ПЦР и секвенирована с использованием MiSeq. Чтения будут обрабатываться в базе данных грибов UNITE, а таблицы классификации будут созданы на уровне видов, родов и OTU для статистического анализа.

Анализ экспрессии: исследователи определят, выражают ли эти геномно измененные опухоли специфические изменения в сигнальных белках, используя иммуногистохимическое окрашивание (IHC) и профилирование белков с помощью белковых матриц. Срезы FFPE или замороженные ткани будут собираться вместе с исследованием характеристик генома для анализа IHC или профилирования белка. Для анализа ИГХ или профилирования белка будет использоваться в общей сложности 5 FFPE-слайдов для ИГХ или экстракции белка для профилирования белка, как было опубликовано ранее. РНК будет извлечена и подвергнута анализу РНК, включая секвенирование РНК, массив экспрессии и анализ ОТ-ПЦР, чтобы определить специфические паттерны экспрессии генов опухолей пищевода, а также экспрессию потенциальных биомаркеров.

Бактериальная культура: чтобы лучше понять роль микробиома в качестве биомаркера в образцах тканей OESCC, будут культивированы бактерии, выявленные при секвенировании, для значительного обогащения опухолей. Образцы тканей мацерировали в асептических условиях одноразовыми скальпелями и встряхивали в течение 30 секунд в PBS (500 мкл), а чистые суспензии использовали для приготовления 10-кратных 2 ) разведений. Каждая чистая суспензия (50 мкл) была нанесена на кровяной агар (BA), анаэробный агар прихотливых (FAA) (BA и FAA с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови; TCS Biosciences Ltd.) и агар Сабуро (Lab MTM; International Diagnostics Group). ООО). Разведения и окончательные промывки образцов PBS (см. выше) наносили на BA и FAA. Чашки с агаром БА и Сабуро инкубировали в аэробных условиях при 37°С в течение 48 часов. Планшеты с АУК инкубировали в анаэробном шкафу при 36°С в течение 96 часов.

Показатели результатов

1. Выживаемость без локо-регионарных рецидивов будет регистрироваться с момента постановки диагноза до момента локального, регионарного или местного и регионарного рецидива.
2. Выживаемость по конкретному заболеванию будет регистрироваться с момента постановки диагноза до момента смерти от OESCC.
3. Общая выживаемость будет регистрироваться с момента постановки диагноза до момента смерти от всех причин.

Статистический анализ Связь между микробами, хирургическим лечением и метаданными отдельных лиц (например, пол, возраст, курение, употребление алкоголя, стадии T/N, выживаемость, рецидив) будет проанализирована с использованием сочетания ординации, непараметрического многомерного дисперсионного анализа, матричная корреляция, критерий хи-квадрат, обобщенная линейная модель или модели условной логистической регрессии. Эффективность окончательных биомаркеров будет оцениваться путем перекрестной проверки и суммироваться по показателю c-индекса для оценки соответствия между модельной и сравнительной группами с использованием кривых ROC. Все поправки множественного тестирования будут выполняться путем вычисления FDR с использованием метода Бенджамини-Хохенберга, а скорректированные значения p <0,05 будут считаться статистически значимыми.