식도 편평 세포 암종의 마이크로바이옴

식도 암종은 전 세계 암 관련 사망의 6번째 주요 원인으로 전 세계 암 부담 순위에 크게 기여합니다. 식도 편평 세포 암종(OESCC)은 전 세계 일부 지역, 특히 아시아의 중국과 일본에서 가장 흔한 유형의 상부 위장관(UGI) 암종 중 하나입니다. 이 질병은 주로 진단의 후기 단계와 원격 전이 가능성이 높기 때문에 전체 5년 생존율이 30% 미만인 극도로 나쁜 예후를 보입니다. OESCC는 흡연과 알코올을 포함한 위험 요인과 관련이 있지만 OESCC의 병인은 여전히 ​​잘 알려져 있지 않습니다.

증가하는 증거는 발암에서 박테리아 미생물총의 핵심 역할을 나타냅니다. 새로운 데이터는 인간 마이크로바이옴이 다양한 암, 특히 결장직장암의 푸소박테리움과 위암의 헬리코박터와 관련이 있음을 시사합니다. 위장관을 식민지화하는 박테리아 미생물 군집의 컨소시엄은 광범위하고 복잡한 방식으로 상호 작용합니다. 마이크로바이옴은 유전적 및 환경적 요인과 상호작용하여 다른 기능 중에서 식이 성분 및 생체이물질을 대사할 수 있습니다. 미생물의 균형이 깨지면 미생물군은 숙주 세포의 증식과 사멸을 변화시키고, 면역 체계를 조작하고, 숙주 대사에 영향을 미쳐 암종을 일으킬 수 있습니다. 여러 연구에서 상부 위장관 암종에서 인간 미생물총의 중요한 역할을 보고했으며 미생물군과 UGI관의 일부 질병(예: 식도염 및 바렛 식도, 식도의 편평 이형성증 및 편평암종) 사이의 연관성을 발견했습니다. 덜 알려진 또 다른 것은 OESCC에서 곰팡이 미생물의 역할입니다.

여기에서 조사관은 OESCC에서 박테리아 및 진균 미생물 군집의 역할과 OESCC의 이해 및 관리에 역할을 할 수 있는 숙주 미생물 상호 작용을 평가하려고 합니다.

학습 질문:

1. OESCC와 정상 환자 사이의 마이크로바이옴이 다른가요?
2. 마이크로바이옴이 정상에서 전암을 거쳐 악성으로 변합니까?
3. 마이크로바이옴과 OESCC의 개발 또는 진행과 관련된 메커니즘은 무엇입니까?

연구 설계:

이것은 전향적 연구입니다. 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행됩니다.

환자는 2020년 6월부터 2025년 5월까지 Prince of Wales 병원에서 모집됩니다. 새로 진단된 OESCC 또는 식도 편평 이형성증 환자 100명이 테스트 그룹에 모집됩니다. 악성 병력 없이 식도위십이지장내시경검사(OGD)를 받는 100명의 환자를 대조군으로 모집합니다. 피험자 참여 예상 기간은 2개월 미만입니다.

연구는 다음과 같이 두 번의 방문을 포함합니다.

1. 방문 1:

   나. 프로젝트에 대해 논의하고 정보에 입각한 동의서에 서명하기 위해 ii. 구강 린스 20ml를 모으기 위해; iii. 설문지를 작성하려면: Gut Microbe - 의료 및 건강 설문지.

2. 방문 2:

OGD를 갖기 위해. 방문 2는 방문 1 후 2개월 이내에 수행되며 치료 전에 반드시 수행되어야 합니다.

나. 시험군: 종양의 생검, 인접한 정상 조직의 생검으로 병변을 검사하고 생리 식염수로 씻어냅니다.

ii. 대조군: 정상 조직의 생검을 하고 생리식염수로 세척합니다.

샘플 크기 타당성:

이것은 OESCC에 기반한 이전 데이터가 없는 전향적 연구입니다. 그러나 전통적인 위험 요인과 중복되는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)의 데이터를 기반으로 연구자들은 적어도 100명의 OESCC 환자와 100명의 건강한 피험자를 모집하는 것을 목표로 합니다. 54개의 HNSCC 종양 조직과 인접한 정상 조직을 사용한 HNSCC 연구에서 대조군과 사례를 구별할 수 있는 16S rRNA 짧은 판독값을 생성했습니다. >0.1% 평균 상대 풍부도를 갖는 총 77개의 박테리아 속이 종양 조직에서 관찰되었다. 희박 분석은 35개의 샘플 중 어느 것에서든 최소 73개의 속이 검출될 수 있음을 나타냈으며, 이는 환자 100명과 대조군 100명의 모집이 구강 박테리아의 거의 전체 스펙트럼을 포함하는 최소화된 샘플 크기를 충족하고 0.8 및 0.8의 검정력을 가질 것으로 예상됨을 시사합니다. 사례와 대조군 사이의 구강 미생물 불균형을 특성화하기 위한 95%의 신뢰 수준.

독립 변수

메틸화 패널과 OESCC의 연관성을 평가하기 위해 다음 독립 변수를 검사합니다.

1. 임상적 요인: 질환의 TNM 병기, 동반이환;
2. 암 위험 요인: 흡연 이력, 음주;
3. 환자 요인: 성별, 연령;
4. 조직학적 특성: 종양 깊이, 피막외 전이, 림프혈관 침습, 신경주위 침습.

견본:

구강 헹굼: 절차 전에 모든 환자에게 20ml 생리 식염수로 구강을 헹구도록 요청하여 구강 헹굼을 수행합니다. 결과 솔루션은 후속 분석을 위해 보관됩니다.

내시경 시술 내시경 시술은 상부 내시경 시술에 대한 전문성을 갖춘 의사가 시행합니다. Prince of Wales 병원의 통합 내시경 센터에서 시행될 것입니다. 국소 국소 마취제가 구인두에 적용될 것입니다. 배율/이중 초점 및 NBI 기능이 있는 내시경이 사용됩니다. 더 나은 초점 거리 조정을 위해 소프트 블랙 후드가 내시경 끝에 부착됩니다.

테스트 그룹의 환자는 종양 생검 1회와 인접한 정상 식도 점막 생검 1회로 내시경 검사를 받게 됩니다. 또한 20ml 생리 식염수로 식도를 부드럽게 씻어내고 분석을 위해 유체를 흡입하고 수집하여 식도 세척을 수행합니다.

대조군의 환자는 일반적인 임상 실습에 따라 내시경 검사를 받게 됩니다. 분석을 위해 정상적인 식도 점막에서 한 번의 생검을 채취합니다. 유사하게 식도 헹굼이 수행됩니다.

실험 DNA 추출 및 중아황산염 변형: 미세해부된 신선한 조직 및 타액의 DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하고, 100% 에탄올에 침전시키고, 5100rpm에서 45분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 두 번 세척하고, LoTE 완충액(10mM TRIS 염산염, 1mM EDTA 버퍼, pH 8), -80°C에서 보관합니다.

RNA 추출: 신선한 조직은 RNA 추출을 위해 RNAlater에 보관하고 -80°C에 보관합니다.

게놈 분석: 카피 수 이상 및 단일 뉴클레오티드 변이에 대한 차세대 시퀀싱 분석을 활용하여 이전에 설명한 바와 같이 샷건 대규모 병렬 시퀀싱을 사용하여 수집된 샘플을 분석합니다. 또한 시퀀싱을 사용하여 코호트의 미생물군을 분석할 것입니다. 박테리아 16S rRNA 유전자 시퀀싱: DNA 분취량을 사용하여 16S rRNA 유전자 V3-V4 영역 앰플리콘 시퀀싱 24를 사용하여 구강 미생물 군집을 스크리닝합니다. 최신 Silva 리보솜 RNA 데이터베이스가 포함된 QIIME2는 샘플당 박테리아 판독 비율을 보여주는 운영 분류표와 함께 앰플리콘 서열 변형을 분류하는 데 사용될 것입니다. Mycobiota ITS 유전자 시퀀싱: 우리는 구강 진균 군집을 특성화하기 위해 mycobiota 내부 전사된 스페이서 유전자(ITS)를 표적으로 삼을 것입니다. ITS1의 짧은 영역(~270bp)은 MiSeq를 사용하여 PCR 증폭 및 시퀀싱됩니다. 읽기는 곰팡이 UNITE 데이터베이스에 대해 처리되며 분류 테이블은 통계 분석을 위해 종, 속 및 OTU 수준에서 생성됩니다.

발현 분석: 조사관은 면역조직화학적 염색(IHC) 및 단백질 어레이에 의한 단백질 프로파일링을 사용하여 이러한 유전적으로 변경된 종양이 신호 단백질의 특정 변화를 표현하는지 여부를 결정할 것입니다. FFPE 섹션 또는 냉동 조직은 IHC 분석 또는 단백질 프로파일링을 위한 게놈 특성 연구와 함께 수확됩니다. IHC 분석 또는 단백질 프로파일링의 경우 이전에 게시된 대로 단백질 프로파일링을 위한 IHC 또는 단백질 추출에 총 5개의 FFPE 슬라이드가 사용됩니다. RNA를 추출하여 식도 종양의 특정 유전자 발현 패턴과 잠재적인 바이오마커의 발현을 결정하기 위해 RNA-seq, 발현 어레이 및 RT-PCR 분석을 포함한 RNA 분석을 실시할 것입니다.

박테리아 배양: OESCC 조직 표본에서 바이오마커로서의 마이크로바이옴의 역할을 더 이해하기 위해 시퀀싱에서 종양이 상당히 풍부한 것으로 확인된 박테리아에 대해 배양됩니다. 조직 표본을 일회용 메스로 무균 침지시키고 PBS(500ℓ)에서 30초 동안 와동시키고, 깔끔한 현탁액을 사용하여 10배 2) 희석액을 만들었다. 깔끔한 현탁액(50ℓ)을 각각 혈액 한천(BA), 까다로운 혐기성 한천(FAA)(BA 및 FAA에 5% 탈피브린 양 혈액이 보충됨; TCS Biosciences Ltd.) 및 Sabouraud's 한천(Lab MTM; International Diagnostics Group)에 뿌렸습니다. PLC). 표본의 희석액 및 최종 PBS 세척액(위 참조)을 BA 및 FAA에 도포했습니다. BA 및 Sabouraud의 한천 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 호기적으로 배양했습니다. FAA 플레이트는 36°C에서 96시간 동안 혐기성 캐비닛에서 배양되었습니다.

결과 측정

1. 국소 재발 없는 생존은 진단 시점부터 재발 시점까지 국소적으로, 국소적으로 또는 국소적으로 기록될 것이다.
2. 질병 특이적 생존은 OESCC에서 진단 시점부터 사망 시점까지 기록됩니다.
3. 전체 생존은 진단 시점부터 모든 원인으로 인한 사망 시점까지 기록됩니다.

미생물, 수술 치료 및 개인의 메타데이터(예: 성별, 연령, 흡연, 음주, T/N 단계, 생존, 재발) 사이의 통계적 분석 연관성은 안수, 비모수적 다변량 분산 분석의 혼합을 사용하여 분석됩니다. 행렬 상관관계, 카이제곱 테스트, 일반화 선형 모델 또는 조건부 로지스틱 회귀 모델. 최종 바이오마커의 성능은 교차 검증에 의해 평가되고 c-지수 점수로 요약되어 ROC 곡선을 사용하여 모델과 비교 그룹 간의 일치성을 평가합니다. 모든 다중 테스트 수정은 BenjaminiHochenberg 방법을 사용하여 FDR을 계산하여 수행되며 조정된 p 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.