Il microbioma del carcinoma a cellule squamose dell'esofago

Il carcinoma esofageo contribuisce in modo significativo alla classifica globale del carico di cancro come la sesta causa principale di morte globale correlata al cancro. Il carcinoma esofageo a cellule squamose (OESCC) è uno dei tipi più comuni di carcinoma del tratto gastrointestinale superiore (UGI) in alcune regioni del mondo, in particolare in Cina e Giappone in Asia. La malattia ha una prognosi estremamente sfavorevole, con tassi di sopravvivenza complessivi a 5 anni inferiori al 30%, principalmente a causa della fase tardiva della diagnosi e dell'elevata probabilità di metastasi a distanza. Sebbene l'OESCC sia associato a fattori di rischio tra cui il fumo e l'alcool, l'eziologia dell'OECC è ancora poco conosciuta.

Prove crescenti indicano un ruolo chiave del microbiota batterico nella cancerogenesi. Dati emergenti implicano il microbioma umano in una varietà di tumori, in particolare Fusobacterium nel cancro del colon-retto e Helicobacter nel cancro gastrico. Il consorzio del microbioma batterico che colonizza il tratto gastrointestinale è ampio e interagisce in modo complesso. Il microbioma può interagire con fattori genetici e ambientali per metabolizzare costituenti dietetici e xenobiotici, tra le altre funzioni. Quando l'equilibrio microbico è disturbato, il microbiota potrebbe alterare la proliferazione e la morte delle cellule ospiti, manipolare il sistema immunitario e influenzare il metabolismo dell'ospite, dando origine al carcinoma. Diversi studi hanno riportato un ruolo importante del microbiota umano nel carcinoma del tratto gastrointestinale superiore e hanno trovato associazioni tra il microbiota e alcune malattie del tratto UGI, come l'esofagite e l'esofago di Barrett, e con la displasia squamosa e il carcinoma squamoso dell'esofago. Un altro ancora meno noto è il ruolo del microbioma fungino in OESCC.

Qui gli investigatori cercheranno di valutare il ruolo del microbioma batterico e fungino in OESCC e le interazioni del microbio ospite che possono svolgere un ruolo nella comprensione e nella gestione di OESCC.

Domande di studio:

1. Il microbioma differisce tra OESCC e pazienti normali?
2. Il microbioma cambia da normale attraverso premalignità a malignità?
3. Quali sono i meccanismi coinvolti nel microbioma e nello sviluppo o nella progressione dell'OECC?

Disegno dello studio:

Questo è uno studio prospettico. Lo studio sarà condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

I pazienti saranno reclutati dal Prince of Wales Hospital da giugno 2020 a maggio 2025. 100 pazienti con OESCC di nuova diagnosi o displasia squamosa esofagea saranno reclutati nel gruppo di prova. 100 pazienti sottoposti a esofagogastroduodenoscopia (OGD) senza una storia di malignità saranno reclutati nel gruppo di controllo. La durata prevista della partecipazione dei soggetti è inferiore a due mesi.

Lo studio prevede due visite, così suddivise:

1. Visita 1:

   io. Discutere del progetto e firmare il modulo di consenso informato; ii. Per raccogliere collutorio orale 20ml; iii. Per completare il questionario: Gut Microbe - Questionario medico e sanitario.

2. Visita 2:

Per avere OGD. La visita 2 verrà eseguita entro due mesi dalla visita 1 e deve essere effettuata prima del trattamento.

io. Gruppo di test: con esame della lesione con biopsia del tumore, biopsia del tessuto normale adiacente, irrigazione con soluzione fisiologica normale.

ii. Gruppo di controllo: avrà una biopsia del tessuto normale e laverà con soluzione salina normale.

Giustificazione della dimensione del campione:

Questo è uno studio prospettico senza dati precedenti basati su OESCC. Ma sulla base dei dati del carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) con una certa sovrapposizione nei fattori di rischio tradizionali, i ricercatori mirano a reclutare almeno 100 pazienti OESCC e 100 soggetti sani. Nello studio HNSCC utilizzando 54 tessuti tumorali HNSCC e i tessuti normali adiacenti ha generato letture brevi di rRNA 16S in grado di discriminare i casi dai controlli. Nei tessuti tumorali è stato osservato un totale di 77 generi batterici con un'abbondanza relativa media >0,1%. Un'analisi di rarefazione ha indicato che almeno 73 generi possono essere rilevati da uno qualsiasi dei 35 campioni, suggerendo che il reclutamento di 100 pazienti e 100 controlli soddisfa la dimensione minima del campione per contenere uno spettro quasi completo di batteri orali e dovrebbe avere una potenza di 0,8 e livello di confidenza del 95% per caratterizzare la disbiosi del microbiota orale tra casi e controlli.

Variabili indipendenti

Le seguenti variabili indipendenti saranno esaminate per valutare l'associazione del pannello di metilazione e OESCC:

1. Fattori clinici: stadiazione TNM della malattia, comorbilità;
2. Fattori di rischio di cancro: storia del fumo, consumo di alcol;
3. Fattori del paziente: sesso, età;
4. Caratteristiche istologiche: profondità del tumore, diffusione extracapsulare, invasione linfovascolare, invasione perineurale.

Campioni:

Risciacquo orale: prima della procedura, verrà eseguito un risciacquo orale chiedendo a tutti i pazienti di sciacquare la cavità orale con 20 ml di soluzione fisiologica. La soluzione risultante verrebbe conservata per analisi successive.

Procedure endoscopiche Le procedure endoscopiche verrebbero eseguite da medici esperti nell'esecuzione dell'endoscopia superiore. Sarebbe condotto presso il Combined Endoscopy Center, Prince of Wales Hospital. Anestetico locale topico verrà applicato all'orofaringe. Verrebbero utilizzati endoscopi con ingrandimento / doppia messa a fuoco e funzione NBI. Un morbido cappuccio nero verrebbe attaccato alla punta dell'endoscopio per una migliore regolazione della lunghezza focale.

I pazienti nel gruppo di test verrebbero quindi sottoposti a endoscopia con una biopsia del tumore e una biopsia della mucosa esofagea normale adiacente. Inoltre, il risciacquo esofageo verrebbe eseguito anche lavando delicatamente l'esofago con 20 ml di soluzione salina normale e il fluido aspirato e raccolto per l'analisi.

I pazienti nel gruppo di controllo sarebbero sottoposti a endoscopia secondo la normale pratica clinica. Una biopsia verrebbe prelevata dalla normale mucosa esofagea per l'analisi. Allo stesso modo, verrebbe eseguito il risciacquo esofageo.

Esperimenti Estrazione del DNA e modificazione del bisolfito: DNA da tessuti freschi microdissezionati e saliva sarà estratto con fenolo-cloroformio, precipitato in 100% etanolo, centrifugato a 5100 rpm per 45 minuti, lavato in 70% etanolo due volte, sciolto in tampone LoTE (10mM TRIS cloridrato, tampone EDTA 1 mM, pH 8) e conservato a -80°C.

Estrazione dell'RNA: il tessuto fresco sarà successivamente conservato in RNA per l'estrazione dell'RNA e conservato a -80°C.

Analisi genomica: utilizzo dell'analisi di sequenziamento di nuova generazione per le aberrazioni del numero di copie e le variazioni di singoli nucleotidi per analizzare i campioni raccolti utilizzando il sequenziamento massiccio parallelo del fucile come descritto in precedenza. Useremo anche il sequenziamento per analizzare il microbiota della coorte. Sequenziamento del gene 16S rRNA batterico: un'aliquota di DNA verrà utilizzata per lo screening della comunità microbica orale utilizzando il sequenziamento dell'amplicone della regione V3-V4 del gene 16S rRNA 24. QIIME2 con l'ultimo database di RNA ribosomiale Silva verrà utilizzato per classificare la variante di sequenza dell'amplicone, con una tabella tassonomica operativa che mostra la proporzione di letture batteriche per campione. Sequenziamento del gene ITS del micobiota: mireremo al gene spaziatore trascritto interno (ITS) del micobiota per caratterizzare la comunità fungina orale. Una piccola regione di ITS1 (~270 bp) sarà amplificata mediante PCR e sequenziata utilizzando MiSeq. Le letture saranno elaborate rispetto a un database UNITE fungino e le tabelle di classificazione saranno generate a livello di specie, generi e OTU per analisi statistiche.

Analisi dell'espressione: gli investigatori determineranno se questi tumori genomicamente alterati esprimono cambiamenti specifici nelle proteine ​​​​di segnalazione utilizzando la colorazione immunoistochimica (IHC) e il profilo proteico mediante array di proteine. Sezioni FFPE o tessuti congelati saranno raccolti insieme allo studio di caratterizzazione genomica per analisi IHC o profili proteici. Per l'analisi IHC o la profilazione proteica, verrà impiegato un totale di 5 vetrini FFPE per l'estrazione IHC o proteica per la profilazione proteica come precedentemente pubblicato. L'RNA sarà estratto e sottoposto ad analisi dell'RNA, tra cui RNA-seq, expression array e analisi RT-PCR in modo da determinare specifici pattern di espressione genica dei tumori esofagei, così come l'espressione di potenziali biomarcatori.

Coltura batterica: per comprendere ulteriormente il ruolo del microbioma come biomarcatore nei campioni di tessuto OESCC verranno coltivati ​​i batteri identificati nel sequenziamento per essere significativamente arricchiti nei tumori. I campioni di tessuto sono stati macerati in modo asettico con bisturi monouso e vortexati per 30 secondi in PBS (500 l), e le sospensioni pure sono state utilizzate per effettuare diluizioni 10 volte 2 ). Ciascuna sospensione pura (50 l) è stata distribuita su agar sangue (BA), agar per anaerobi esigenti (FAA) (BA e FAA integrati con il 5% di sangue di montone defibrinato; TCS Biosciences Ltd.) e agar Sabouraud (Lab MTM; International Diagnostics Group plc). Le diluizioni e i lavaggi finali con PBS dei campioni (vedi sopra) sono stati distribuiti su BA e FAA. Le piastre di agar BA e Sabouraud sono state incubate in aerobiosi a 37°C per 48 ore. Le piastre FAA sono state incubate in un armadio anaerobico a 36°C per 96 ore.

Misure di risultati

1. La sopravvivenza libera da recidiva loco-regionale sarà registrata dal momento della diagnosi al momento della recidiva a livello locale, regionale o locale e regionale.
2. La sopravvivenza specifica per malattia sarà registrata dal momento della diagnosi al momento della morte da OESCC.
3. La sopravvivenza globale sarà registrata dal momento della diagnosi al momento della morte per tutte le cause.

Analisi statistica L'associazione tra microbi, trattamento chirurgico e metadati degli individui (ad es. sesso, età, fumo, alcol, stadi T/N, sopravvivenza, recidiva) sarà analizzata utilizzando un mix di ordinazione, analisi multivariata non parametrica della varianza, correlazione matriciale, test chi-quadrato, modello lineare generalizzato o modelli di regressione logistica condizionale. Le prestazioni dei biomarcatori finali saranno valutate mediante convalida incrociata e riassunte dal punteggio c-index per valutare la concordanza tra il modello e i gruppi di confronto utilizzando le curve ROC. Tutte le correzioni di test multipli saranno eseguite calcolando i FDR utilizzando il metodo BenjaminiHochenberg e i valori p aggiustati <0,05 saranno considerati statisticamente significativi.