新型コロナウイルス感染症が疑われる症状のある患者における SARS-CoV-2 検出のための ddPCR 技術の評価 (ONCOVID-21)

Bio-Rad SARS-CoV-2 ddPCR 検査は、検体（主に鼻咽頭、前鼻、中咽頭、中咽頭）中の SARS-CoV-2 からの RNA を検出するように設計された逆転写（RT）液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ddPCR）検査です。鼻甲介スワブだけでなく、鼻咽頭洗浄液/吸引液および鼻吸引液の検体も含む)は、新型コロナウイルス感染症の疑いのある個人から収集されました。

このシングルアッセイマルチプレックステストにより、CDC によって報告された 3 セットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを使用した 1 ウェル反応が可能になります。 ウイルスのヌクレオカプシド (N) 遺伝子の領域から 2 つが選択されました。 パネルに含まれる追加のプライマー/プローブは、対照サンプルおよび臨床検体中のヒト RNase P 遺伝子 (RP) を検出するように設定されています。

綿棒標本から単離および精製された RNA は、逆転写酵素で構成されるマスターミックスに添加され、それによって RNA は cDNA に変換され、その後、Bio-Rad プローブ用ワンステップ RT-ddPCR アドバンスト キットを使用して増幅されます。

簡単に説明すると、サンプルとマスターミックスの RT-ddPCR 混合物は、油中水型エマルションの形態で最大 20,000 ナノリットル サイズの液滴に分別されます。 液滴を含む 96 ウェル RT-ddPCR 対応プレートを、プレート シーラーを使用してホイルでシールします。 次に、エマルジョンを熱サイクルして逆転写を行って cDNA を生成し、続いて各液滴でターゲットの増幅とプローブの加水分解を行います。 サーモサイクリングが完了したら、96 ウェル RT-ddPCR 対応プレートを Droplet Reader にロードします。 ドロップレット リーダーは、液滴を単一化し、2 色の蛍光検出器 (FAM および HEX) を通過させて、SARS-CoV- で識別された各ターゲットについてどれがターゲットを含んでいるか (陽性)、どれが含まれていないか (陰性) を判断します。 2 ddPCR 検査: N1、N2、RP。 ddPCR システムは、分析ソフトウェアとして QuantaSoft 1.7 および QuantaSoft Analysis Pro 1.0 を使用します。