Evaluering av en ddPCR-teknologi for SARS-CoV-2-deteksjon hos symptomatiske pasienter med mistanke om COVID-19 (ONCOVID-21)

Bio-Rad SARS-CoV-2 ddPCR-testen er en revers transkripsjon (RT) dråpereaksjonstest for digital polymerasekjedereaksjon (ddPCR) designet for å oppdage RNA fra SARS-CoV-2 i prøver (hovedsakelig nasofaryngeal, anterior nasal, orofaryngeal og mid-svelg). turbinat vattpinne, men også nasofaryngeal vask/aspirat og nasal aspiratprøver) tatt fra individer som er mistenkt for COVID-19-infeksjon.

Denne multiplekstesten med enkelt analyse muliggjør en én-brønns reaksjon med tre sett med oligonukleotidprimere og prober som ble rapportert av CDC. To ble valgt fra områder av virusnukleokapsid (N) genet. En ekstra primer/probe inkludert i panelet er satt til å detektere det humane RNase P-genet (RP) i kontrollprøver og kliniske prøver.

RNA isolert og renset fra vattpinneprøver tilsettes masterblandingen som består av revers transkriptase, hvorved RNA omdannes til cDNA og deretter amplifiseres ved bruk av Bio-Rad One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes.

Kort fortalt blir prøven og mastermix RT-ddPCR-blandingene fraksjonert i opptil 20 000 nanoliter-størrelse dråper i form av en vann-i-olje-emulsjon. Den 96-brønners RT-ddPCR-klare platen som inneholder dråper, forsegles med folie ved hjelp av en plateforsegler. Emulsjonene blir deretter termosyklet for å oppnå revers transkripsjon for å generere cDNA etterfulgt av målamplifisering pluss probehydrolyse i hver dråpe. Etter at termosykling er fullført, lastes den 96-brønners RT-ddPCR-klare platen inn i dråpeleseren. Dråpeleseren enkeltviser dråpene og flyter dem forbi en tofarget fluorescensdetektor (FAM og HEX) for å bestemme hvilke som inneholder mål (positive) og hvilke som ikke (negative) for hvert av målene identifisert med SARS-CoV- 2 ddPCR-test: N1, N2 og RP. ddPCR-systemet bruker QuantaSoft 1.7 og QuantaSoft Analysis Pro 1.0 for analyseprogramvare.