歯髄壊死および慢性根尖性歯周炎患者における同種 MSC の移植 (MSC)

この研究に含まれる患者の歯内処置は、感染プロセスの証拠のない根尖性歯周炎を伴う歯髄壊死の症例に焦点を当てます。

材料および方法。 試薬 ヒト分化抗原 (CD34、CD45、CD14、CD90、CD73、CD29、CD49b、CD166) に対するマウス モノクローナル抗体は、フルオレセイン イソチオシアネート (CFI) またはフィコエリトリン (PE) に結合し、BD Biosciences (USA) から購入しました。

ヒト骨髄から得られた間葉系間質細胞 (MSC) の分離と培養。 本研究では、心的外傷後非癒合 (骨折部位での骨癒合の失敗) と診断された患者の骨髄 (BM) から分離された EMF が使用されます。 これらの細胞を偽関節症部位に移植して、これらの患者の骨再生を誘導した。 EMF 移植による骨再生のプロトコルは、カラカス大学病院、ロス アンデス大学病院、ペレス デ レオン II 病院で実施され、インフォームド コンセントを通じて各機関および各患者の生命倫理委員会の承認を得ています。 このプロトコルでは、各患者の BM は、腸骨稜の穿刺によって分離されました。 この手順は、手術室で麻酔下で専門医によって行われました。 MO 吸引物は、ヘパリン (Sanofi Aventis) を含む α-MEM 培地 (Invitrogen、米国) に配置されました。 単核細胞をFicoll-Hypaque勾配（GE Healthcare、Sweden）での遠心分離によって分離し、20％自己血清で強化されたalpha-MEM-Chang培地（Irvine Scientific、USA）で培養しました。 これらの細胞は、37ºC、5% CO2 の制御された環境で培養されました。 ７２時間後、非接着細胞を除去し、基礎培養培地（α－ＭＥＭ－Ｃｈａｎｇ／２０％自己血清）を添加した。 プラスチックへの付着により、MSCが分離されました。 培養液の交換は、70～80%近くのコンフルエンスに達するまで行いました。 上記のプロセスに従って、培養物を剥がすことによってＭＳＣを増殖させた。 微生物学的検査は、BM を取得した後、MSC 移植を実行する前に実行されました。 MSC を使用した後、これらの細胞のバッチを -70 -C で凍結保存しました。

MSC の表現型の特徴付け。 MSC の表現型特徴付け研究は、フローサイトメトリーによって実施されました。 MO接着細胞は、トリプシン様酵素を使用して培養フラスコから分離されました。 続いて、細胞をＭＳＣマーカー（ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ１６６およびＣＤ４９ｂ）および造血（ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１４）に特異的な抗体と共にインキュベートした。 発現マーカーのサイトメトリー分析は、各患者の移植に使用された細胞の 100% が MSC であることを示しました。

MSC 分化研究。 MSCの多能性分化能力は、これらの細胞を骨形成、軟骨形成、および脂肪生成分化培地で培養することにより、以前に記載された方法と同様の方法に従って調べられました。 簡単に説明すると、MSC を分離し、ウェルあたり 5x104 の細胞密度で 24 ウェル培養プレートに播種し、対応する分化培地を追加しました。 骨形成分化のために、ＭＳＣを、デキサメタゾン（１００ｎＭ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アスコルビン酸（１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、無機リン酸（１．８ｍＭ、Ｍｅｒｃｋ）およびベータグリセロールリン酸（２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）で強化された基礎培地の存在下で培養した。 軟骨形成分化のために、細胞を軟骨細胞用の市販の培地（Cell Application、米国）で培養し、脂肪生成系統への分化のために、市販の培地NH Adipodiff Human（Miltenyi、米国）を使用しました。 すべての場合において、細胞は4～5日ごとに培地を交換しながら21～28日間培養を続けた。 分化プロセスに関連する変化を実証するために、細胞をパラホルムアルデヒド（Merck、USA）を使用して固定し、それぞれのケースで特定の染色を行いました。 簡単に説明すると、カルシウム沈着を検出するアリザリンレッド (骨形成の証拠)、プロテオグリカンを検出するアルシアンブルー (軟骨形成の証拠)、および脂質 (脂肪生成の証拠) を検出するオイルレッド (オイルレッド) です。 いずれの場合も、顕微鏡観察と写真登録を行った。 内皮分化 (CEn) のために、EMF は、10% 自己血清、10 μg/ml のヒト上皮成長因子 (hu-EGF、R&D) およびヒドロコルチゾン (1 μg/ml、Sigma) で強化された MCDB 131 培地 (Invitrogen、米国) で培養されました。 .

歯髄壊死および根尖性歯周炎患者におけるMSC移植。 すべての MSC 処理手順は、適正製造基準 (GMP) の基準に従って、IVIC 細胞治療ユニットのクリーンルームで実行されます。 外傷後癒合不全と診断され、これらの細胞の移植で治療された患者からの同種異系ＢＭ－ＭＳＣは、骨再生を誘導するために使用される。 このプロトコルで使用される MSC は、以前に表現型および機能的に特徴付けられています。 MSC は、前述のように解凍、成長、拡張されます。 細胞の一部はMSC用の培地に保持され、別の部分は内皮分化培地（CEM-Endo）で培養されます。 MSC および MSC-Endo の必要数に達したら、これらの細胞の懸濁液 (それぞれから 75,000 細胞) を、フェノールレッドを含まず、20% 自家細胞を添加した DMEM-F12 培地を含む無菌培養チューブに入れます。血清。 MSC / MSC-Endo を含む各試験管は、室温で、小さな生物学的サンプル輸送セラーで、Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) の歯科サービスに輸送されます。

無菌条件下で、患者は患部の歯の部分に局所麻酔されます。影響を受けた歯の根管が露出され、MSC / MSC-Endo / PRP インプラントを実行する準備が整います。 同時に、培養上清を各チューブから除去し、CEM/CEM-Endo「ボタン (ペレット)」を自家多血小板血漿 (PRP) に再懸濁します。 その後、MSC / Endo / PRP 懸濁液に 5% CaCl2 とトロンビンを加えます。 血餅が形成される直前に、20 マイクロリットルの CEM / CEM-Endo / PRP 懸濁液を根管に入れ、コラーゲン膜で覆います。 続いて、バイオセラミックスによる閉塞処置が歯髄チャンバーのレベルで行われ、アイオノマーガラスがバイオセラミックスを保護し、その後コンポジットレジンが歯を修復します。

EMFの移植後の臨床評価

1. 0、7、30、90、180、364日目に臨床対照（顔面評価、歯肉評価、先端触診、水平および垂直パーカッション、寒冷および熱感受性試験）を実施する。 さらに、臨床評価は EMC の移植後 2 年で実施されます。
2. 放射線管理は、0、7、30、90、180、および 364 日目に実施されます。 さらに、間葉系間質細胞の移植から 2 年後に実施されます。
3. 根尖修復が根尖レントゲン写真で明らかになったら、トモグラフィー評価を行います。