牙髓坏死和慢性根尖周炎患者的同种异体间充质干细胞移植 (MSC)

本研究中包括的患者的牙髓手术将侧重于没有感染过程证据的牙髓坏死伴根尖周炎的病例。

材料和方法。 试剂针对人分化抗原（CD34、CD45、CD14、CD90、CD73、CD29、CD49b、CD166）的小鼠单克隆抗体与异硫氰酸荧光素 (CFI) 或藻红蛋白 (PE) 偶联，购自 BD Biosciences（美国）。

从人骨髓中分离和培养间充质基质细胞 (MSC)。 在本研究中，将使用来自诊断为创伤后骨不连（骨折部位骨愈合失败）的患者骨髓 (BM) 的分离 EMF。 这些细胞被移植到假关节部位以诱导这些患者的骨再生。 通过 EMF 移植进行骨再生的协议在加拉加斯大学医院、洛斯安第斯大学医院、佩雷斯德莱昂二世医院进行，并通过知情同意获得每个机构和每位患者的生物伦理委员会的批准。 在该协议中，每位患者的 BM 都通过髂嵴的穿刺来隔离。 该程序在手术室中由医学专家在麻醉下进行。 将 MO 抽吸物置于含有肝素 (Sanofi Aventis) 的 alpha-MEM 培养基 (Invitrogen, USA) 中。 通过在 Ficoll-Hypaque 梯度（GE Healthcare，Sweden）上离心分离单核细胞，并在富含 20% 自体血清的 alpha-MEM-Chang 培养基（Irvine Scientific，USA）中培养。 这些细胞在 37ºC 和 5% CO2 的受控环境中培养。 72小时后，去除非贴壁细胞，加入基础培养基（α-MEM-Chang/20%自体血清）。 它们对塑料的粘附隔离了 MSC。 进行培养基交换直至达到接近 70-80% 的融合。 按照上述过程，通过剥离培养物来扩增 MSC。 在获得 BM 之后和进行 MSC 植入之前进行微生物学检查。 使用 MSC 后，将一批这些细胞冷冻保存在 -70 -C。

MSC 的表型特征。 MSC 的表型特征研究通过流式细胞术进行。 为此，使用胰蛋白酶样酶将 MO 贴壁细胞从培养瓶中分离出来。 随后，将细胞与 MSC 标记物（CD90、CD73、CD105、CD29、CD166 和 CD49b）和造血细胞（CD34、CD45 和 CD14）特异性抗体一起孵育。 表达标记物的流式细胞仪分析表明，每位患者用于移植的细胞 100% 是 MSC。

MSC 分化研究。 按照类似于先前描述的方法，通过在成骨、软骨形成和脂肪形成分化培养基中培养这些细胞来检查 MSC 的多能分化能力。 简而言之，将 MSCs 分离并以每孔 5x104 的细胞密度接种在 24 孔培养板中，然后添加相应的分化培养基。 对于成骨分化，在富含地塞米松（100nM，Biotech）、抗坏血酸（10mM，Sigma）、无机磷酸盐（1.8mM，Merck）和β-甘油磷酸盐（2mM，Sigma）的基础培养基存在的情况下培养 MSC。 对于软骨形成分化，细胞在用于软骨细胞的商业培养基（Cell Application，USA）中培养，并且为了向脂肪形成谱系分化，使用商业培养基 NH Adipodiff Human（Miltenyi，USA）。 在所有情况下，细胞都保持培养 21-28 天，每 4-5 天更换一次培养基。 为了证明与分化过程相关的变化，使用多聚甲醛（默克公司，美国）固定细胞，并对每个病例​​进行特定染色。 简言之，茜素红检测钙沉积（成骨证据），阿尔新蓝检测蛋白多糖（软骨形成证据），油红（油红）检测脂质（脂肪形成证据）。 在所有情况下，都进行了显微镜观察和照相配准。 对于内皮分化 (CEn)，EMF 在富含 10% 自体血清、10µg/ml 人表皮生长因子（hu-EGF，R&D）和氢化可的松（1µg/ml，Sigma）的 MCDB 131 培养基（Invitrogen，美国）中培养.

MSC 植入牙髓坏死和根尖周炎患者。 所有 MSC 处理程序都将按照良好生产规范 (GMP) 的标准在 IVIC 细胞治疗单元的洁净室中进行。 来自诊断为创伤后骨不连并接受这些细胞植入治疗的患者的同种异体 BM-MSC 将用于诱导骨再生。 在该协议中使用的 MSC 以前已经在表型和功能上进行了表征。 MSC 将如前所述解冻、生长和扩增。 一部分细胞将保存在 MSCs 的培养基中，另一部分将在内皮分化培养基 (CEM-Endo) 中培养。 一旦达到所需的 MSCs 和 MSCs-Endo 数量，这些细胞的悬浮液（每个细胞 75,000 个细胞）将被放置在含有 DMEM-F12 培养基的无菌培养管中，不含酚红，辅以 20% 自体血清。 每个装有 MSC / MSC-Endo 的试管将在室温下在小型生物样品运输地窖中运输到委内瑞拉科学调查研究所 (IVIC) 的牙科服务处。

在无菌条件下，患者将在受影响的牙齿区域进行局部麻醉；受影响牙齿的根管将被暴露并准备执行 MSC / MSC-Endo / PRP 种植体。 同时，从每个试管中去除培养基上清液，并将 CEM / CEM-Endo“按钮（颗粒）”重新悬浮在自体富血小板血浆 (PRP) 中。 随后向 MSC/Endo/PRP 悬浮液中加入 5% CaCl2 和凝血酶。 在凝块形成之前，立即将 20 微升 CEM / CEM-Endo / PRP 悬浮液放入根管中，并覆盖一层胶原膜。 随后，将在牙髓室水平进行生物陶瓷充填，离聚物玻璃保护生物陶瓷，然后使用复合树脂修复牙齿。

EMF植入后临床评价

1. 将在第 0、7、30、90、180 和 364 天进行临床对照（面部评估、牙龈评估、根尖触诊、水平和垂直叩诊、冷热敏感性测试）。 此外，将在 EMC 植入后两年进行临床评估。
2. 放射控制将在第 0、7、30、90、180 和 364 天进行。 此外，它们将在间充质基质细胞植入后两年进行。
3. 当根尖周片修复在根尖周片中很明显时，将进行断层扫描评估。