Transplantace alogenního MSC u pacientů s pulpní nekrózou a chronickou apikální parodontitidou (MSC)

Endodontický výkon u pacientů zařazených do této studie se zaměří na případy nekrózy dřeně s apikální parodontitidou bez známek infekčních procesů.

MATERIÁLY A METODY. Činidla Myší monoklonální protilátky, namířené proti lidským diferenciačním antigenům (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), konjugované s fluorescein isothiokyanátem (CFI) nebo fykoerythrinem (PE) byly zakoupeny od BD Biosciences (USA).

Izolace a kultivace mezenchymálních stromálních buněk (MSC) získaných z lidské kostní dřeně. V této studii budou použity izolované EMP z kostní dřeně (BM) od pacientů s diagnózou posttraumatického nesjednocení (selhání kostního srůstu v místech zlomenin). Tyto buňky byly transplantovány do místa pseudoartrózy, aby se u těchto pacientů indukovala kostní regenerace. Protokol pro regeneraci kosti pomocí transplantace EMF byl proveden v Univerzitní nemocnici v Caracasu, v nemocnici Universitario de Los Andes, v nemocnici Pérez de León II a má souhlas bioetických komisí každé instituce a každého pacienta na základě informovaného souhlasu. V tomto protokolu byla BM každého pacienta izolována punkcí v hřebenu kyčelní kosti. Tento zákrok byl proveden na operačním sále, v narkóze a odborným lékařem. MO aspirát byl umístěn do média alfa-MEM (Invitrogen, USA) s heparinem (Sanofi Aventis). Mononukleární buňky byly odděleny centrifugací na Ficoll-Hypaque gradientu (GE Healthcare, Švédsko) a kultivovány v médiu alfa-MEM-Chang (Irvine Scientific, USA) obohaceném 20% autologním sérem. Tyto buňky byly udržovány v kultuře v kontrolovaném prostředí při 37ºC a 5% CO2. Po 72 hodinách byly neadherentní buňky odstraněny a bylo přidáno základní kultivační médium (alfa-MEM-Chang / 20% autologní sérum). Jejich přilnavost k plastu izolovala MSC. Výměny kultivačního média byly prováděny až do dosažení konfluence blízké 70-80 %. MSC byly expandovány loupáním kultur podle postupu popsaného výše. Mikrobiologická vyšetření byla provedena po získání BM a před provedením implantace MSC. Po použití MSC byla dávka těchto buněk kryokonzervována při -70 °C.

Fenotypová charakterizace MSC. Studie fenotypové charakterizace MSC byly provedeny průtokovou cytometrií. K tomu byly MO adherentní buňky odděleny z kultivační lahve pomocí enzymů podobných trypsinu. Následně byly buňky inkubovány s protilátkami specifickými pro MSC markery (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 a CD49b) a hematopoetické (CD34, CD45 a CD14). Cytometrická analýza expresních markerů ukázala, že 100 % buněk použitých k transplantaci u každého pacienta byly MSC.

MSC diferenciační studie. Multipotenciální diferenciační kapacita MSC byla zkoumána kultivací těchto buněk v osteogenních, chondrogenních a adipogenních diferenciačních médiích podle metodologie podobné té, která byla popsána dříve. Stručně, MSC byly odpojeny a naočkovány do 24jamkových kultivačních destiček v buněčné hustotě 5x104 na jamku, přičemž bylo přidáno odpovídající diferenciační médium. Pro osteogenní diferenciaci byly MSC kultivovány v přítomnosti bazálního média obohaceného dexamethasonem (100 nM, Biotech), kyselinou askorbovou (10 mM, Sigma), anorganickým fosfátem (1,8 mM, Merck) a beta-glycerol fosfátem (2 mM, Sigma). Pro chondrogenní diferenciaci byly buňky kultivovány v komerčním médiu pro chondrocyty (Cell Application, USA) a pro diferenciaci směrem k adipogenní linii bylo použito komerční médium NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA). Ve všech případech byly buňky udržovány v kultuře po dobu 21-28 dnů s výměnou média každých 4-5 dnů. Pro demonstraci změn spojených s procesem diferenciace byly buňky fixovány pomocí paraformaldehydu (Merck, USA) a pro každý případ byla provedena specifická barvení. Stručně řečeno, alizarinová červeň pro detekci ukládání vápníku (důkaz osteogeneze), alciánská modř pro detekci proteoglykanů (důkaz chondrogeneze) a olejová červeň (Oil Red) pro zobrazení lipidů (důkaz adipogeneze). Ve všech případech bylo provedeno mikroskopické pozorování a fotografická registrace. Pro endoteliální diferenciaci (CEn) byly EMF kultivovány v médiu MCDB 131 (Invitrogen, USA) obohaceném o 10% autologní sérum, 10 ug/ml lidského epidermálního růstového faktoru (hu-EGF, R&D) a hydrokortison (1 ug/ml, Sigma) .

Implantace MSC u pacientů s nekrózou pulpy a apikální parodontitidou. Všechny postupy zpracování MSC budou prováděny v čisté místnosti jednotky IVIC Cell Therapy v souladu se standardy správné výrobní praxe (GMP). Alogenní BM-MSC od pacientů s diagnózou posttraumatického nezhojení a léčených implantací těchto buněk budou použity k indukci kostní regenerace. MSC, které mají být použity v tomto protokolu, byly dříve fenotypově a funkčně charakterizovány. MSC bude rozmražen, pěstován a expandován, jak bylo popsáno dříve. Část buněk bude uchovávána v médiu pro MSC a další část bude kultivována v endoteliálním diferenciačním médiu (CEM-Endo). Po dosažení požadovaného počtu MSC a MSC-Endo bude suspenze těchto buněk (75 000 buněk z každé z nich) umístěna do sterilních kultivačních zkumavek obsahujících kultivační médium DMEM-F12, bez fenolové červeně, doplněné 20% autologní sérum. Každá zkumavka obsahující MSC / MSC-Endo bude přepravena v malém sklepě pro přepravu biologického vzorku při pokojové teplotě do stomatologické služby Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Za sterilních podmínek bude pacient lokálně znecitlivěn v oblasti postiženého zubu; kořenový kanálek ​​postiženého zubu bude obnažen a připraven k provedení implantátu MSC / MSC-Endo / PRP. Současně se z každé zkumavky odstraní supernatant kultivačního média a "tlačítko (peleta)" CEM / CEM-Endo se resuspenduje v autologní plazmě bohaté na krevní destičky (PRP). Následně se k suspenzi MSC/Endo/PRP přidá 5% CaCl2 a trombin. Okamžitě a před vytvořením sraženiny se 20 mikrolitrů suspenze CEM / CEM-Endo / PRP umístí do kořenového kanálku pokrytého kolagenovou membránou. Následně bude provedena obturační procedura biokeramikou na úrovni dřeňové komory, ionomerního skla pro ochranu biokeramické a později kompozitní pryskyřice pro obnovu zubu.

Postimplantační klinické hodnocení EMP

1. Klinické kontroly (hodnocení obličeje, hodnocení gingivy, apikální palpace, horizontální a vertikální perkuse, testy citlivosti na chlad a teplo) budou prováděny ve dnech 0, 7, 30, 90, 180 a 364. Kromě toho bude provedeno klinické hodnocení dva roky po implantaci EMC.
2. Radiologické kontroly budou probíhat ve dnech 0, 7, 30, 90, 180 a 364. Navíc budou provedeny dva roky po implantaci mezenchymálních stromálních buněk.
3. Tomografické hodnocení bude provedeno, když bude periapikální oprava patrná na periapikálním rentgenovém snímku.