Allogén MSC átültetése pulpanekrózisban és krónikus apikális periodontitisben szenvedő betegeknél (MSC)

A vizsgálatba bevont betegek endodontiai eljárása az apikális parodontitissel járó pulpanekrózis eseteire összpontosít, fertőző folyamatok bizonyítéka nélkül.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK. Reagensek A humán differenciálódási antigének (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166) elleni, fluoreszcein-izotiocianáthoz (CFI) vagy fikoeritrinhez (PE) konjugált egér monoklonális antitesteket az s Bioscience-től (BDUSAscience) vásároltuk.

Humán csontvelőből nyert mesenchymalis stromasejtek (MSC) izolálása és tenyésztése. Ebben a tanulmányban a csontvelőből (BM) származó izolált EMF-eket használnak olyan betegeknél, akiknél poszttraumás nem-egyesülés (a törés helyén a csontszövet kudarca) diagnosztizáltak. Ezeket a sejteket átültettük a pszeudoartrózis helyére, hogy ezekben a betegekben csontregenerációt indukáljunk. Az EMF-transzplantációval történő csontregeneráció protokollját a Caracas-i Egyetemi Kórházban, az Universitario de Los Andes-i Kórházban, a Pérez de León II Kórházban hajtották végre, és minden intézmény bioetikai bizottsága és minden beteg beleegyezésével jóváhagyta. Ebben a protokollban minden egyes páciens BM-jét a csípőtarajban végzett punkcióval izoláltuk. Ezt a beavatkozást a műtőben, altatásban, szakorvos végezte. Az MO aspirátumot alfa-MEM táptalajba (Invitrogen, USA) helyeztük heparinnal (Sanofi Aventis). A mononukleáris sejteket Ficoll-Hypaque gradiensen (GE Healthcare, Svédország) végzett centrifugálással választottuk el, és 20% autológ szérummal dúsított alfa-MEM-Chang tápközegben (Irvine Scientific, USA) tenyésztettük. Ezeket a sejteket tenyészetben tartottuk ellenőrzött környezetben 37ºC-on és 5% CO2-on. 72 óra elteltével a nem tapadó sejteket eltávolítottuk, és alaptenyésztő tápközeget (alfa-MEM-Chang / 20% autológ szérum) adtunk hozzá. A műanyaghoz való tapadásuk izolálta az MSC-ket. A tápközeg cseréjét addig végeztük, amíg el nem értek a 70-80%-hoz közeli összefolyást. Az MSC-ket a tenyészetek hámozásával szaporítottuk a fent leírt eljárás szerint. Mikrobiológiai vizsgálatokat végeztünk a BM megszerzése után és az MSC beültetés előtt. Az MSC alkalmazása után ezeknek a sejteknek egy tételét -70 °C-on mélyhűtöttük.

Az MSC fenotípusos jellemzése. Az MSC fenotípusos jellemzési vizsgálatait áramlási citometriával végeztük. Ehhez a MO-tapadó sejteket tripszinszerű enzimek segítségével leválasztottuk a tenyészlombikról. Ezt követően a sejteket MSC markerekre (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 és CD49b) és hematopoetikus (CD34, CD45 és CD14) specifikus antitestekkel inkubáltuk. Az expressziós markerek citometrikus analízise azt mutatta, hogy az egyes betegekben a transzplantációhoz használt sejtek 100%-a MSC volt.

MSC differenciációs tanulmányok. Az MSC-k multipotenciális differenciálódási képességét úgy vizsgáltuk, hogy ezeket a sejteket oszteogén, kondrogén és adipogén differenciálódási tápközegben tenyésztjük, a korábban leírthoz hasonló módszertant követve. Röviden, az MSC-ket leválasztottuk, és 24 lyukú tenyésztőlemezekre oltottuk 5x104/lyuk sejtsűrűséggel, majd hozzáadtuk a megfelelő differenciáló táptalajt. Az oszteogén differenciálódás érdekében az MSC-ket dexametazonnal (100 nM, Biotech), aszkorbinsavval (10 mM, Sigma), szervetlen foszfáttal (1,8 mM, Merck) és béta-glicerin-foszfáttal (2 mM, Sigma) dúsított bazális táptalaj jelenlétében tenyésztettük. A kondrogén differenciálódáshoz a sejteket kereskedelmi forgalomban kapható kondrociták táptalajban (Cell Application, USA), az adipogén vonal felé történő differenciálódáshoz pedig a kereskedelmi forgalomban lévő NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA) táptalajt használtuk. A sejteket minden esetben 21-28 napig tartottuk tenyészetben 4-5 naponkénti táptalajcserével. A differenciálódási folyamattal járó változások kimutatására a sejteket paraformaldehiddel (Merck, USA) fixáltuk, és minden esetben specifikus festést végeztünk. Röviden, az alizarin vörös a kalcium lerakódás kimutatására (az oszteogenezis bizonyítéka), az Alcián kék a proteoglikánok kimutatására (a kondrogenezis bizonyítéka), az olajvörös (az olajvörös) a lipidek kimutatására (az adipogenezis bizonyítéka). Minden esetben mikroszkópos megfigyelést és fényképes regisztrálást végeztünk. Az endoteliális differenciálódáshoz (CEn) az EMF-eket 10% autológ szérummal, 10 µg/ml humán epidermális növekedési faktorral (hu-EGF, R&D) és hidrokortizonnal (1 µg/ml, Sigma) dúsított MCDB 131 tápközegben (Invitrogen, USA) tenyésztettük. .

MSC beültetés pulpanekrózisban és apikális periodontitisben szenvedő betegeknél. Az összes MSC feldolgozási eljárást az IVIC sejtterápiás egység tisztaterében hajtják végre a helyes gyártási gyakorlat (GMP) szabványainak megfelelően. A poszttraumás nem egyesüléssel diagnosztizált és ezen sejtek beültetésével kezelt betegek allogén BM-MSC-jét a csontregeneráció indukálására használják fel. Az ebben a protokollban használandó MSC-t korábban fenotípusosan és funkcionálisan jellemezték. Az MSC-t a korábban leírtak szerint felolvasztják, növesztik és tágítják. A sejtek egy részét MSC-tápközegben tartják, egy másik részét pedig endoteliális differenciáló tápközegben (CEM-Endo) tenyésztik. Miután elérte a szükséges számú MSC-t és MSC-Endo-t, ezeknek a sejteknek a szuszpenzióját (75 000 sejt mindegyikből) steril tenyésztőcsövekbe helyezik, amelyek DMEM-F12 táptalajt tartalmaznak fenolvörös nélkül, kiegészítve 20% autológgal. szérum. Minden MSC / MSC-Endo tubust egy kis biológiai minta szállító pincében, szobahőmérsékleten szállítanak az Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) Fogorvosi Szolgálatába.

Steril körülmények között a pácienst helyi érzéstelenítik az érintett fogterületen; az érintett fog gyökércsatornáját feltárják és előkészítik az MSC / MSC-Endo / PRP beültetés elvégzésére. Ezzel egyidejűleg a tápközeg felülúszóját eltávolítjuk minden csőből, és a CEM/CEM-Endo "gombot (pellet)" újraszuszpendáljuk autológ vérlemezkében gazdag plazmában (PRP). Ezt követően az MSC/Endo/PRP szuszpenzióhoz 5% CaCl2-t és trombint adunk. Közvetlenül a vérrög kialakulása előtt 20 mikroliter CEM/CEM-Endo/PRP szuszpenziót helyezünk a gyökércsatornába, kollagén membránnal lefedve. Ezt követően a biokerámiával végzett obturációs eljárást a pépkamra, ionomer üveg szintjén hajtják végre a biokerámia védelmére, majd a kompozit gyanta szintjén a fog helyreállítására.

Az EMF beültetés utáni klinikai értékelése

1. A klinikai kontrollokat (arc-értékelés, gingivális értékelés, apikális tapintás, vízszintes és függőleges ütés, hideg- és hőérzékenységi tesztek) a 0., 7., 30., 90., 180. és 364. napon végezzük. Ezenkívül az EMC beültetése után két évvel klinikai értékelést is végeznek.
2. A radiológiai ellenőrzéseket a 0., 7., 30., 90., 180. és 364. napon hajtják végre. Ezenkívül két évvel a mesenchymalis stromasejtek beültetése után végzik el.
3. A tomográfiás értékelésre akkor kerül sor, ha a periapikális röntgenfelvételen láthatóvá válik a periapikális helyreállítás.