Transplantatie van allogene MSC bij patiënten met pulpanecrose en chronische apicale parodontitis (MSC)

De endodontische procedure bij de patiënten die in deze studie zijn opgenomen, zal zich richten op gevallen van pulpanecrose met apicale parodontitis zonder bewijs van infectieuze processen.

MATERIALEN EN METHODES. Reagentia Monoklonale antilichamen van muizen, gericht tegen menselijke differentiatie-antigenen (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), geconjugeerd aan fluoresceïne-isothiocyanaat (CFI) of fycoerythrine (PE) werden gekocht bij BD Biosciences (VS).

Isolatie en kweek van mesenchymale stromale cellen (MSC) verkregen uit menselijk beenmerg. In de huidige studie zullen geïsoleerde EMV's uit het beenmerg (BM) van patiënten met een diagnose van posttraumatische non-union (falen van een bot-union op breuklocaties) worden gebruikt. Deze cellen werden getransplanteerd naar de plaats van pseudoartrose om botregeneratie bij deze patiënten te induceren. Het protocol voor botregeneratie door middel van EMF-transplantatie werd uitgevoerd in het Universitair Ziekenhuis van Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II en heeft de goedkeuring van de bio-ethische commissies van elke instelling en elke patiënt door middel van geïnformeerde toestemming. In dit protocol werd de BM van elke patiënt geïsoleerd door een punctie in de bekkenkam. Deze ingreep is uitgevoerd in de operatiekamer, onder narcose en door een medisch specialist. Het MO-aspiraat werd in alfa-MEM-medium (Invitrogen, VS) met heparine (Sanofi Aventis) geplaatst. De mononucleaire cellen werden gescheiden door centrifugatie op een Ficoll-Hypaque-gradiënt (GE Healthcare, Zweden) en gekweekt in alfa-MEM-Chang-medium (Irvine Scientific, VS) verrijkt met 20% autoloog serum. Deze cellen werden in kweek gehouden in een gecontroleerde omgeving bij 37ºC en 5% CO2. Na 72 uur werden niet-hechtende cellen geëlimineerd en werd een basaal kweekmedium (alpha-MEM-Chang / 20% autoloog serum) toegevoegd. Hun gehechtheid aan het plastic isoleerde de MSC's. Uitwisselingen van kweekmedium werden uitgevoerd totdat een confluentie van bijna 70-80% werd bereikt. De MSC's werden geëxpandeerd door de culturen te pellen volgens het hierboven beschreven proces. Microbiologische onderzoeken werden uitgevoerd na het verkrijgen van de BM en vóór het uitvoeren van de MSC-implantatie. Na gebruik van MSC werd een batch van deze cellen gecryopreserveerd bij -70°C.

Fenotypische karakterisering van MSC. Fenotypische karakteriseringsstudies van MSC werden uitgevoerd door middel van flowcytometrie. Waarvoor de MO-aanhangende cellen werden losgemaakt van de kweekfles met behulp van trypsine-achtige enzymen. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met antilichamen die specifiek zijn voor MSC-markers (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 en CD49b) en hematopoietische (CD34, CD45 en CD14). Cytometrische analyse van de expressiemarkers toonde aan dat 100% van de cellen die voor transplantatie bij elke patiënt werden gebruikt, MSC waren.

MSC-differentiatiestudies. Het multipotentiële differentiatievermogen van MSC's werd onderzocht door deze cellen te kweken in osteogene, chondrogene en adipogene differentiatiemedia, volgens een methodologie die vergelijkbaar is met die eerder beschreven. In het kort werden de MSC's losgemaakt en gezaaid in kweekplaten met 24 putjes bij een celdichtheid van 5x104 per putje, waarna het overeenkomstige differentiatiemedium werd toegevoegd. Voor osteogene differentiatie werden MSC's gekweekt in aanwezigheid van basaal medium verrijkt met dexamethason (100 nM, Biotech), ascorbinezuur (10 mM, Sigma), anorganisch fosfaat (1,8 mM, Merck) en beta-glycerolfosfaat (2 mM, Sigma). Voor chondrogene differentiatie werden cellen gekweekt in een commercieel medium voor chondrocyten (Cell Application, VS) en voor differentiatie naar de adipogene afstamming werd het commerciële medium NH Adipodiff Human (Miltenyi, VS) gebruikt. In alle gevallen werden de cellen 21-28 dagen in kweek gehouden met gemiddelde veranderingen om de 4-5 dagen. Om de veranderingen in verband met het differentiatieproces aan te tonen, werden de cellen gefixeerd met behulp van paraformaldehyde (Merck, VS) en werden voor elk geval specifieke kleuringen uitgevoerd. Kortom, alizarinerood om calciumafzetting te detecteren (bewijs van osteogenese), Alcian-blauw om proteoglycanen te detecteren (bewijs van chondrogenese) en olierood (Oil Red) om lipiden te zien (bewijs van adipogenese). In alle gevallen werden microscopische observatie en fotografische registratie uitgevoerd. Voor endotheeldifferentiatie (CEn) werden EMF's gekweekt in MCDB 131-medium (Invitrogen, VS) verrijkt met 10% autoloog serum, 10 μg / ml menselijke epidermale groeifactor (hu-EGF, R&D) en hydrocortison (1 μg / ml, Sigma) .

MSC-implantatie bij patiënten met pulpanecrose en apicale parodontitis. Alle MSC-verwerkingsprocedures worden uitgevoerd in de cleanroom van de IVIC celtherapie-eenheid volgens de normen van goede productiepraktijken (GMP). Allogene BM-MSC van patiënten met de diagnose posttraumatische non-union en behandeld met implantatie van deze cellen zal worden gebruikt om botregeneratie te induceren. De in dit protocol te gebruiken MSC zijn eerder fenotypisch en functioneel gekarakteriseerd. De MSC zal worden ontdooid, gekweekt en uitgebreid zoals eerder beschreven. Een deel van de cellen wordt bewaard in een medium voor MSC's en een ander deel wordt gekweekt in endotheliaal differentiatiemedium (CEM-Endo). Zodra het vereiste aantal MSC's en MSC's-Endo is bereikt, wordt een suspensie van deze cellen (75.000 cellen van elk van hen) in steriele kweekbuizen geplaatst met DMEM-F12-kweekmedium, zonder fenolrood, aangevuld met 20% autoloog serum. Elke buis met MSC / MSC-Endo wordt in een kleine biologische monstertransportkelder bij kamertemperatuur naar de tandheelkundedienst van het Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) vervoerd.

Onder steriele omstandigheden wordt de patiënt plaatselijk verdoofd in het aangetaste tandgebied; het wortelkanaal van de aangetaste tand wordt blootgelegd en voorbereid voor het implanteren van de MSC / MSC-Endo / PRP. Tegelijkertijd wordt het supernatant van het kweekmedium uit elk buisje verwijderd en wordt de CEM/CEM-Endo "knop (pellet)" opnieuw gesuspendeerd in autoloog bloedplaatjesrijk plasma (PRP). Aansluitend aan de MSC/Endo/PRP suspensie wordt 5% CaCl2 en trombine toegevoegd. Onmiddellijk, en voordat het stolsel zich vormt, wordt 20 microliter van de CEM / CEM-Endo / PRP-suspensie in het wortelkanaal geplaatst, bedekt met een collageenmembraan. Vervolgens wordt de obturatieprocedure met biokeramiek uitgevoerd op het niveau van de pulpakamer, ionomeer glas om de biokeramiek te beschermen en later composiethars om de tand te herstellen.

Post-implantatie klinische evaluatie van EMF

1. Klinische controles (gezichtsevaluatie, tandvleesevaluatie, apicale palpatie, horizontale en verticale percussie, koude- en hittegevoeligheidstests) zullen worden uitgevoerd op dag 0, 7, 30, 90, 180 en 364. Bovendien zal er twee jaar na implantatie van EMC een klinische evaluatie worden uitgevoerd.
2. Op dag 0, 7, 30, 90, 180 en 364 worden radiologische controles uitgevoerd. Bovendien zullen ze twee jaar na implantatie van mesenchymale stromale cellen worden uitgevoerd.
3. Een tomografische evaluatie zal worden uitgevoerd wanneer het periapicale herstel zichtbaar zal zijn op een periapicale röntgenfoto.