Transplantation af allogen MSC hos patienter med pulpa-nekrose og kronisk apikal parodontitis (MSC)

Den endodontiske procedure hos patienterne inkluderet i denne undersøgelse vil fokusere på tilfælde af pulpa nekrose med apikale parodontitis uden tegn på infektiøse processer.

MATERIALER OG METODER. Reagenser Murine monoklonale antistoffer, rettet mod humane differentieringsantigener (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), konjugeret til fluorescein isothiocyanat (CFI) eller phycoerythrin (PE) blev købt fra BD Biosciences (USA).

Isolering og dyrkning af mesenkymale stromale celler (MSC) opnået fra human knoglemarv. I denne undersøgelse vil isolerede EMF'er fra knoglemarv (BM) fra patienter med diagnosen posttraumatisk nonunion (svigt i en knogleforening på fraktursteder) blive brugt. Disse celler blev transplanteret ind i pseudoarthrose-stedet for at inducere knogleregenerering hos disse patienter. Protokollen for knogleregenerering gennem EMF-transplantation blev udført på universitetshospitalet i Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II og har godkendelse fra de bioetiske komitéer for hver institution og hver patient gennem informeret samtykke. I denne protokol blev BM af hver patient isoleret ved en punktering i hoftekammen. Denne procedure blev udført på operationsstuen, under anæstesi og af en speciallæge. MO-aspiratet blev anbragt i alfa-MEM-medium (Invitrogen, USA) med heparin (Sanofi Aventis). De mononukleære celler blev adskilt ved centrifugering på en Ficoll-Hypaque-gradient (GE Healthcare, Sverige) og dyrket i alfa-MEM-Chang-medium (Irvine Scientific, USA) beriget med 20% autologt serum. Disse celler blev holdt i kultur i et kontrolleret miljø ved 37ºC og 5% CO2. Efter 72 timer blev ikke-adhærente celler elimineret, og et basalt dyrkningsmedium (alfa-MEM-Chang / 20 % autologt serum) blev tilsat. Deres overholdelse af plastikken isolerede MSC'erne. Kulturmedieudvekslinger blev foretaget, indtil de nåede et sammenløb tæt på 70-80 %. MSC'erne blev udvidet ved at skrælle kulturerne ved at følge den ovenfor beskrevne proces. Mikrobiologiske undersøgelser blev udført efter opnåelse af BM og før udførelse af MSC-implantation. Efter anvendelse af MSC blev en batch af disse celler kryokonserveret ved -70 -C.

Fænotypisk karakterisering af MSC. Fænotypiske karakteriseringsundersøgelser af MSC blev udført ved flowcytometri. For hvilke de MO-adhærente celler blev løsrevet fra dyrkningskolben ved anvendelse af trypsinlignende enzymer. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med antistoffer, der er specifikke for MSC-markører (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 og CD49b) og hæmatopoietiske (CD34, CD45 og CD14). Cytometrisk analyse af ekspressionsmarkørerne viste, at 100 % af de celler, der blev brugt til transplantation i hver patient, var MSC.

MSC differentieringsundersøgelser. Den multipotentielle differentieringskapacitet af MSC'er blev undersøgt ved at dyrke disse celler i osteogene, chondrogene og adipogene differentieringsmedier efter en metode svarende til den tidligere beskrevet. Kort fortalt blev MSC'erne løsnet og podet i kulturplader med 24 brønde ved en celletæthed på 5x104 pr. brønd, hvorved man fortsatte med at tilføje det tilsvarende differentieringsmedium. Til osteogen differentiering blev MSC'er dyrket i nærværelse af basalt medium beriget med dexamethason (100 nM, Biotech), ascorbinsyre (10 mM, Sigma), uorganisk fosfat (1,8 mM, Merck) og beta-glycerolphosphat (2 mM, Sigma). Til chondrogen differentiering blev celler dyrket i et kommercielt medium for chondrocytter (Cell Application, USA) og til differentiering mod den adipogene afstamning blev det kommercielle medium NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA) anvendt. I alle tilfælde blev cellerne holdt i kultur i 21-28 dage med mediumskift hver 4.-5. dag. For at demonstrere ændringerne forbundet med differentieringsprocessen blev cellerne fikseret ved hjælp af paraformaldehyd (Merck, USA), og specifikke farvninger blev udført for hvert tilfælde. Kort fortalt, alizarinrød til at detektere calciumaflejring (bevis på osteogenese), Alcianblå til at påvise proteoglycaner (bevis på chondrogenese) og olierød (olierød) for at se lipider (bevis på adipogenese). I alle tilfælde blev der foretaget mikroskopisk observation og fotografisk registrering. Til endothelial differentiering (CEn) blev EMF'er dyrket i MCDB 131 medium (Invitrogen, USA) beriget med 10% autologt serum, 10µg/ml human epidermal vækstfaktor (hu-EGF, R&D) og hydrocortison (1µg/ml, Sigma) .

MSC-implantation hos patienter med pulpa-nekrose og apikal parodontitis. Alle MSC-behandlingsprocedurer vil blive udført i renrummet i IVIC-celleterapienheden i overensstemmelse med standarderne for god fremstillingspraksis (GMP). Allogen BM-MSC fra patienter diagnosticeret med posttraumatisk nonunion og behandlet med implantation af disse celler vil blive brugt til at inducere knogleregenerering. MSC'en, der skal bruges i denne protokol, er tidligere blevet fænotypisk og funktionelt karakteriseret. MSC'en vil blive optøet, dyrket og udvidet som tidligere beskrevet. En del af cellerne vil blive holdt i et medium til MSC'er, og en anden del vil blive dyrket i endotel-differentieringsmedium (CEM-Endo). Når det nødvendige antal MSC'er og MSC'er-Endo er nået, vil en suspension af disse celler (75.000 celler fra hver af dem) blive placeret i sterile dyrkningsrør indeholdende DMEM-F12 dyrkningsmedium, uden phenolrødt, suppleret med 20% autologt serum. Hvert rør, der indeholder MSC / MSC-Endo, vil blive transporteret i en lille biologisk prøvetransportkælder ved stuetemperatur til tandlægetjenesten under Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Under sterile forhold vil patienten blive lokalbedøvet i det berørte tandområde; rodkanalen af ​​den berørte tand vil blive blotlagt og klargjort til at udføre MSC / MSC-Endo / PRP implantatet. Samtidig fjernes dyrkningsmediesupernatanten fra hvert rør, og CEM/CEM-Endo "knappen (pellet)" resuspenderes i autologt blodpladerigt plasma (PRP). Efterfølgende til MSC / Endo / PRP suspensionen tilsættes 5 % CaCl2 og trombin. Umiddelbart, og før koaglet dannes, vil 20 mikroliter af CEM / CEM-Endo / PRP suspensionen blive placeret i rodkanalen, dækket af en kollagenmembran. Efterfølgende vil obturationsproceduren med biokeramik blive udført i niveau med pulpkammeret, ionomerglas for at beskytte biokeramikken og senere kompositharpiks for at genoprette tanden.

Post-implantation klinisk evaluering af EMF

1. Kliniske kontroller (ansigtsevaluering, tandkødsevaluering, apikal palpation, horisontal og vertikal percussion, kulde- og varmefølsomhedstest) vil blive udført på dag 0, 7, 30, 90, 180 og 364. Derudover vil en klinisk evaluering blive udført i de to år efter implantation af EMC.
2. Radiologiske kontroller vil blive udført på dag 0, 7, 30, 90, 180 og 364. Derudover vil de blive udført to år efter implantation af mesenchymale stromaceller.
3. En tomografisk vurdering vil blive udført, når den periapikale reparation vil være tydelig på et periapikalt røntgenbillede.