Трансплантация аллогенных МСК у больных с некрозом пульпы и хроническим верхушечным периодонтитом (MSC)

Эндодонтическая процедура у пациентов, включенных в это исследование, будет сосредоточена на случаях некроза пульпы с апикальным периодонтитом без признаков инфекционных процессов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Реагенты Мышиные моноклональные антитела, направленные против антигенов дифференцировки человека (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (CFI) или фикоэритрином (PE), были приобретены у BD Biosciences (США).

Выделение и культивирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК), полученных из костного мозга человека. В настоящем исследовании будут использованы изолированные ЭМП костного мозга (КМ) пациентов с диагнозом «посттравматическое несращение» (нарушение сращения костей в местах переломов). Эти клетки были трансплантированы в область псевдоартроза, чтобы вызвать регенерацию кости у этих пациентов. Протокол регенерации кости с помощью трансплантации ЭМП был проведен в Университетской больнице Каракаса, Университетской больнице Лос-Андес, Больнице Перес-де-Леон II и получил одобрение комитетов по биоэтике каждого учреждения и каждого пациента посредством информированного согласия. В этом протоколе костный мозг каждого пациента изолировали путем прокола гребня подвздошной кости. Эта процедура проводилась в операционной под наркозом и врачом-специалистом. Аспират МО помещали в среду альфа-МЕМ (Invitrogen, США) с гепарином (Sanofi Aventis). Мононуклеарные клетки отделяли центрифугированием в градиенте Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Швеция) и культивировали в среде альфа-MEM-Chang (Irvine Scientific, США), обогащенной 20% аутологичной сывороткой. Эти клетки содержали в культуре в контролируемой среде при 37ºC и 5% CO2. Через 72 часа неприлипшие клетки удаляли и добавляли основную культуральную среду (альфа-MEM-Chang/20% аутологичной сыворотки). Их прилипание к пластику изолировало МСК. Замену культуральной среды проводили до достижения степени слияния, близкой к 70-80%. МСК размножали путем шелушения культур, следуя описанному выше процессу. Микробиологические исследования проводили после получения БМ и перед имплантацией МСК. После использования МСК партию этих клеток подвергали криоконсервации при -70 -С.

Фенотипическая характеристика МСК. Изучение фенотипических характеристик МСК проводили методом проточной цитометрии. Для чего прикрепленные к МО клетки отделяли от культурального флакона с помощью трипсиноподобных ферментов. В дальнейшем клетки инкубировали с антителами, специфичными к маркерам МСК (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 и CD49b) и гемопоэтическими (CD34, CD45 и CD14). Цитометрический анализ маркеров экспрессии показал, что 100% клеток, использованных для трансплантации у каждого пациента, были МСК.

Исследования дифференцировки МСК. Способность МСК к мультипотенциальной дифференцировке исследовали путем культивирования этих клеток в остеогенной, хондрогенной и адипогенной среде для дифференцировки, следуя методологии, аналогичной описанной ранее. Вкратце, МСК отделяли и высевали в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью клеток 5×104 на лунку, добавляя соответствующую среду для дифференцировки. Для остеогенной дифференцировки МСК культивировали в присутствии базовой среды, обогащенной дексаметазоном (100 нМ, Biotech), аскорбиновой кислотой (10 мМ, Sigma), неорганическим фосфатом (1,8 мМ, Merck) и бета-глицеролфосфатом (2 мМ, Sigma). Для хондрогенной дифференцировки клетки культивировали в коммерческой среде для хондроцитов (Cell Application, США), а для дифференцировки в сторону адипогенной линии использовали коммерческую среду NH Adipodiff Human (Miltenyi, США). Во всех случаях клетки выдерживали в культуре в течение 21-28 сут со сменой среды каждые 4-5 сут. Для демонстрации изменений, связанных с процессом дифференцировки, клетки фиксировали параформальдегидом (Merck, США) и для каждого случая проводили специфическое окрашивание. Вкратце, ализариновый красный для обнаружения отложений кальция (свидетельство остеогенеза), альциановый синий для обнаружения протеогликанов (свидетельство хондрогенеза) и масляный красный (масляный красный) для выявления липидов (свидетельство адипогенеза). Во всех случаях проводили микроскопическое наблюдение и фоторегистрацию. Для эндотелиальной дифференцировки (CEn) ЭМП культивировали в среде MCDB 131 (Invitrogen, США), обогащенной 10% аутологичной сывороткой, 10 мкг/мл человеческого эпидермального фактора роста (hu-EGF, R&D) и гидрокортизоном (1 мкг/мл, Sigma). .

Имплантация МСК у пациентов с некрозом пульпы и апикальным периодонтитом. Все процедуры обработки МСК будут проводиться в чистой комнате отделения клеточной терапии IVIC в соответствии со стандартами надлежащей производственной практики (GMP). Аллогенные BM-MSC от пациентов с диагнозом посттравматического несращения и пролеченных имплантацией этих клеток будут использоваться для индукции регенерации кости. МСК, которые будут использоваться в этом протоколе, ранее были фенотипически и функционально охарактеризованы. MSC будет разморожен, выращен и расширен, как описано ранее. Часть клеток будет храниться в среде для МСК, а часть будет культивироваться в среде эндотелиальной дифференцировки (СЕМ-Эндо). После достижения необходимого количества МСК и МСК-Эндо суспензию этих клеток (по 75 000 клеток из каждой) помещают в стерильные культуральные пробирки, содержащие питательную среду DMEM-F12, без фенолового красного, с добавлением 20% аутологичных сыворотка. Каждая пробирка, содержащая MSC/MSC-Endo, будет транспортироваться в небольшом подвале для перевозки биологических образцов при комнатной температуре в Стоматологическую службу Венецианского института научных исследований (IVIC).

В стерильных условиях пациенту проводят местную анестезию в области пораженного зуба; корневой канал пораженного зуба будет обнажен и подготовлен для установки имплантата MSC / MSC-Endo / PRP. Одновременно из каждой пробирки удаляют супернатант культуральной среды и ресуспендируют «кнопку (осадок)» СЕМ/СЕМ-Эндо в аутологичной богатой тромбоцитами плазме (PRP). Впоследствии к суспензии MSC/Endo/PRP будут добавлены 5% CaCl2 и тромбин. Немедленно и до образования сгустка в корневой канал, покрытый коллагеновой мембраной, будет помещено 20 мкл суспензии CEM/CEM-Endo/PRP. В последующем будет проведена процедура обтурации биокерамикой на уровне пульповой камеры, иономерным стеклом для защиты биокерамики, а затем композитной смолой для восстановления зуба.

Постимплантационная клиническая оценка ЭМП

1. Клинический контроль (оценка лица, оценка десен, апикальная пальпация, горизонтальная и вертикальная перкуссия, тесты на чувствительность к холоду и теплу) будет проводиться в дни 0, 7, 30, 90, 180 и 364. Кроме того, через два года после имплантации EMC будет проведена клиническая оценка.
2. Радиологический контроль будет проводиться в дни 0, 7, 30, 90, 180 и 364. Кроме того, они будут проводиться через два года после имплантации мезенхимальных стромальных клеток.
3. Томографическая оценка будет выполнена, когда периапикальное восстановление станет очевидным на периапикальной рентгенограмме.