치수 괴사 및 만성 치근단 치주염 환자에서 동종 MSC 이식 (MSC)

이 연구에 포함된 환자의 근관 치료는 감염 과정의 증거가 없는 치근단 치주염을 동반한 치수 괴사 사례에 초점을 맞출 것입니다.

재료 및 방법. 시약 플루오레세인 이소티오시아네이트(CFI) 또는 피코에리트린(PE)에 접합된 인간 분화 항원(CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166)에 대한 마우스 단일클론 항체는 BD Biosciences(USA)에서 구입했습니다.

인간 골수에서 얻은 중간엽 기질 세포(MSC)의 분리 및 배양. 본 연구에서는 외상 후 불유합(골절 부위의 골유합 실패) 진단을 받은 환자의 골수(BM)에서 분리된 EMF를 사용할 것입니다. 이들 세포를 가성관절증 부위에 이식하여 이들 환자의 뼈 재생을 유도했습니다. EMF 이식을 통한 뼈 재생 프로토콜은 카라카스 대학 병원, 로스 안데스 대학 병원, 페레즈 데 레온 II 병원에서 수행되었으며 정보에 입각한 동의를 통해 각 기관 및 각 환자의 생명 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에서 각 환자의 BM은 장골 능선의 천자에 의해 분리되었습니다. 이 절차는 수술실에서 마취 하에 의료 전문가에 의해 수행되었습니다. MO 흡인물을 헤파린(Sanofi Aventis)과 함께 알파-MEM 배지(Invitrogen, USA)에 넣었다. 단핵 세포를 Ficoll-Hypaque 구배(GE Healthcare, Sweden)에서 원심분리하여 분리하고 20% 자가 혈청이 풍부한 alpha-MEM-Chang 배지(Irvine Scientific, USA)에서 배양했습니다. 이들 세포는 37ºC 및 5% CO2의 통제된 환경에서 배양되었습니다. 72시간 후 비부착 세포를 제거하고 기초배양배지(alpha-MEM-Chang/20% autologous serum)를 첨가하였다. 플라스틱에 대한 부착은 MSC를 분리했습니다. 70-80%에 가까운 합류점에 도달할 때까지 배양 배지 교환이 이루어졌습니다. 중간엽 줄기세포는 위에서 설명한 과정에 따라 배양물을 벗겨내어 확장했습니다. BM을 얻은 후 MSC 이식을 수행하기 전에 미생물 검사를 수행했습니다. MSC를 사용한 후, 이들 세포의 배치를 -70 -C에서 동결보존했습니다.

MSC의 표현형 특성. MSC의 표현형 특성화 연구는 유동 세포측정법에 의해 수행되었습니다. 이를 위해 트립신-유사 효소를 사용하여 MO 부착 세포를 배양 플라스크로부터 분리하였다. 이어서, 세포를 MSC 마커(CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 및 CD49b) 및 조혈(CD34, CD45 및 CD14)에 특이적인 항체와 함께 인큐베이션하였다. 발현 마커의 세포측정 분석은 각 환자에서 이식에 사용된 세포의 100%가 MSC임을 보여주었다.

MSC 분화 연구. 이전에 설명한 것과 유사한 방법론에 따라 골 형성, 연골 형성 및 지방 분화 배지에서 이들 세포를 배양하여 MSC의 다능 분화 능력을 조사했습니다. 간략하게, MSC를 분리하고 웰당 5x104의 세포 밀도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고 상응하는 분화 배지를 첨가하였다. 골 형성 분화를 위해 MSC를 덱사메타손(100nM, Biotech), 아스코르빈산(10mM, Sigma), 무기 인산염(1.8mM, Merck) 및 베타-글리세롤 인산염(2mM, Sigma)이 풍부한 기본 배지의 존재 하에 배양했습니다. 연골 분화를 위해 세포를 연골 세포용 상업용 배지(Cell Application, USA)에서 배양하였고, 지방 분화 계통으로의 분화를 위해 상업용 배지 NH Adipodiff Human(Miltenyi, USA)을 사용하였다. 모든 경우에, 세포는 매 4-5일마다 배지를 교환하면서 21-28일 동안 배양물에 보관하였다. 분화 과정과 관련된 변화를 입증하기 위해 파라포름알데히드(Merck, USA)를 사용하여 세포를 고정하고 각 경우에 대해 특정 염색을 수행했습니다. 간단히 말해, 칼슘 침착(골형성의 증거)을 감지하기 위한 알리자린 레드, 프로테오글리칸(연골형성의 증거)을 감지하기 위한 알시안 블루, 지질(지방형성의 증거)을 보기 위한 오일 레드(Oil Red)입니다. 모든 경우에 현미경 관찰 및 사진 정합을 수행하였다. 내피 분화(CEn)를 위해, EMF를 10% 자가 혈청, 10㎍/ml의 인간 상피 성장 인자(hu-EGF, R&D) 및 하이드로코르티손(1㎍/ml, Sigma)이 풍부한 MCDB 131 배지(Invitrogen, USA)에서 배양하였다. .

치수 괴사 및 치근단 치주염 환자에서 MSC 이식. 모든 MSC 처리 절차는 GMP(Good Manufacturing Practice) 기준에 따라 IVIC Cell Therapy Unit의 클린룸에서 수행됩니다. 외상 후 불유합으로 진단되고 이들 세포의 이식으로 치료받은 환자의 동종 BM-MSC는 뼈 재생을 유도하는 데 사용될 것입니다. 이 프로토콜에 사용되는 MSC는 이전에 표현형 및 기능적으로 특성화되었습니다. MSC는 이전에 설명한 대로 해동, 성장 및 확장됩니다. 세포의 일부는 MSC용 배지에 보관하고 다른 일부는 내피 분화 배지(CEM-Endo)에서 배양합니다. MSC 및 MSC-Endo의 필요한 수에 도달하면 이러한 세포의 현탁액(각각 75,000개 세포)을 DMEM-F12 배양 배지가 포함된 멸균 배양 튜브에 넣습니다. 혈청. MSC / MSC-Endo를 포함하는 각 튜브는 작은 생물학적 시료 운반 셀러에서 상온에서 Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas(IVIC)의 치과 서비스로 운반됩니다.

무균 상태에서 환자는 감염된 치아 부위에 국소 마취됩니다. 영향을 받은 치아의 근관이 노출되고 MSC/MSC-Endo/PRP 임플란트를 수행하기 위해 준비됩니다. 동시에, 배양 배지 상청액을 각 튜브로부터 제거하고 CEM/CEM-엔도 "버튼(펠릿)"을 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP)에 재현탁시킨다. MSC/Endo/PRP 서스펜션에 이어 5% CaCl2 및 트롬빈이 추가됩니다. 혈전이 형성되기 직전에 CEM/CEM-Endo/PRP 현탁액 20마이크로리터를 콜라겐 막으로 덮은 근관에 넣습니다. 그 후, 바이오세라믹을 사용한 폐색 절차는 치수강 수준에서 바이오세라믹을 보호하기 위한 아이오노머 유리와 치아를 복원하기 위한 복합 레진으로 수행됩니다.

EMF의 이식 후 임상 평가

1. 0일, 7일, 30일, 90일, 180일 및 364일에 임상 제어(안면 평가, 치은 평가, 치근단 촉진, 수평 및 수직 충격, 냉감 및 열 감도 테스트)을 수행합니다. 또한 EMC 이식 후 2년에 임상 평가를 실시할 예정입니다.
2. 0일, 7일, 30일, 90일, 180일 및 364일에 방사선학적 통제를 실시합니다. 또한 중간엽 기질 세포를 이식한 지 2년 후에 실시할 예정입니다.
3. 치근단 방사선 사진에서 치근단 복구가 분명할 때 단층 촬영 평가가 수행됩니다.