Transplante de CTM alogênicas em pacientes com necrose pulpar e periodontite apical crônica (MSC)

O procedimento endodôntico nos pacientes incluídos neste estudo será focado em casos de necrose pulpar com periodontite apical sem evidências de processos infecciosos.

MATERIAIS E MÉTODOS. Reagentes Anticorpos monoclonais murinos, direcionados contra antígenos de diferenciação humana (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), conjugados com isotiocianato de fluoresceína (CFI) ou ficoeritrina (PE) foram adquiridos da BD Biosciences (EUA).

Isolamento e cultura de células estromais mesenquimais (MSC) obtidas de medula óssea humana. No presente estudo, serão utilizados EMFs isolados da medula óssea (MO) de pacientes com diagnóstico de pseudartrose pós-traumática (falha de união óssea nos locais de fratura). Essas células foram transplantadas para o local da pseudoartrose para induzir a regeneração óssea nesses pacientes. O protocolo de regeneração óssea por transplante de EMF foi realizado no Hospital Universitário de Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II e tem a aprovação dos Comitês de Bioética de cada instituição e de cada paciente mediante consentimento informado. Nesse protocolo, a MO de cada paciente foi isolada por punção na crista ilíaca. Este procedimento foi realizado em centro cirúrgico, sob anestesia e por médico especialista. O aspirado de MO foi colocado em meio alfa-MEM (Invitrogen, EUA) com heparina (Sanofi Aventis). As células mononucleares foram separadas por centrifugação em gradiente Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Suécia) e cultivadas em meio alfa-MEM-Chang (Irvine Scientific, EUA) enriquecido com 20% de soro autólogo. Essas células foram mantidas em cultivo em ambiente controlado a 37ºC e 5% de CO2. Após 72 horas, as células não aderentes foram eliminadas e adicionado um meio de cultura basal (alfa-MEM-Chang / 20% soro autólogo). Sua aderência ao plástico isolou as MSCs. As trocas do meio de cultura foram feitas até atingir uma confluência próxima a 70-80%. As MSCs foram expandidas descascando as culturas, seguindo o processo descrito acima. Os exames microbiológicos foram realizados após a obtenção da MO e antes da realização do implante das MSC. Após o uso de MSC, um lote dessas células foi criopreservado a -70 -C.

Caracterização fenotípica de MSC. Estudos de caracterização fenotípica de MSC foram realizados por citometria de fluxo. Para o qual as células aderentes a MO foram separadas do frasco de cultura usando enzimas do tipo tripsina. Posteriormente, as células foram incubadas com anticorpos específicos para marcadores MSC (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 e CD49b) e hematopoiéticos (CD34, CD45 e CD14). A análise citométrica dos marcadores de expressão mostrou que 100% das células utilizadas para transplante em cada paciente eram MSC.

Estudos de diferenciação MSC. A capacidade de diferenciação multipotencial das MSCs foi examinada por cultivo dessas células em meios de diferenciação osteogênico, condrogênico e adipogênico, seguindo uma metodologia semelhante à descrita anteriormente. Resumidamente, as MSCs foram destacadas e semeadas em placas de cultura de 24 poços com uma densidade celular de 5x104 por poço, procedendo-se à adição do meio de diferenciação correspondente. Para diferenciação osteogênica, as MSCs foram cultivadas na presença de meio basal enriquecido com dexametasona (100nM, Biotech), ácido ascórbico (10mM, Sigma), fosfato inorgânico (1,8mM, Merck) e beta-glicerol fosfato (2mM, Sigma). Para diferenciação condrogênica, as células foram cultivadas em meio comercial para condrócitos (Cell Application, EUA) e para diferenciação para a linhagem adipogênica foi utilizado o meio comercial NH Adipodiff Human (Miltenyi, EUA). Em todos os casos, as células foram mantidas em cultura por 21-28 dias com trocas de meio a cada 4-5 dias. Para demonstrar as alterações associadas ao processo de diferenciação, as células foram fixadas com paraformaldeído (Merck, EUA) e foram realizadas colorações específicas para cada caso. Resumidamente, vermelho de alizarina para detectar deposição de cálcio (evidência de osteogênese), azul Alcian para detectar proteoglicanos (evidência de condrogênese) e vermelho de óleo (Oil Red) para ver lipídios (evidência de adipogênese). Em todos os casos, foi realizada observação microscópica e registro fotográfico. Para diferenciação endotelial (CEn), os EMFs foram cultivados em meio MCDB 131 (Invitrogen, EUA) enriquecido com 10% de soro autólogo, 10µg/ml de fator de crescimento epidérmico humano (hu-EGF, R&D) e hidrocortisona (1µg/ml, Sigma) .

Implante de MSC em pacientes com necrose pulpar e periodontite apical. Todos os procedimentos de processamento de MSC serão realizados na sala limpa da Unidade de Terapia Celular IVIC seguindo os padrões de boas práticas de fabricação (GMP). As BM-MSC alogênicas de pacientes diagnosticados com pseudartrose pós-traumática e tratadas com implantação dessas células serão utilizadas para induzir a regeneração óssea. As MSC a serem utilizadas neste protocolo foram previamente caracterizadas fenotipicamente e funcionalmente. O MSC será descongelado, crescido e expandido conforme descrito anteriormente. Uma parte das células será mantida em meio para MSCs, e outra parte será cultivada em meio de diferenciação endotelial (CEM-Endo). Uma vez atingido o número necessário de MSCs e MSCs-Endo, uma suspensão dessas células (75.000 células de cada uma delas) será colocada em tubos de cultura estéreis contendo meio de cultura DMEM-F12, sem vermelho de fenol, suplementado com 20% de solução autóloga sérum. Cada tubo contendo MSC / MSC-Endo será transportado em uma pequena adega de transporte de amostras biológicas, em temperatura ambiente, para o Serviço de Odontologia do Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Sob condições estéreis, o paciente será anestesiado localmente na área do dente afetada; o canal radicular do dente afetado será exposto e preparado para a realização do implante MSC/MSC-Endo/PRP. Ao mesmo tempo, o sobrenadante do meio de cultura é removido de cada tubo e o "botão (pellet)" CEM/CEM-Endo é ressuspenso em plasma rico em plaquetas (PRP) autólogo. Posteriormente à suspensão de MSC/Endo/PRP, serão adicionados 5% de CaCl2 e trombina. Imediatamente, e antes da formação do coágulo, 20 microlitros da suspensão CEM/CEM-Endo/PRP serão colocados no canal radicular, cobertos com uma membrana de colágeno. Posteriormente, será realizado o procedimento de obturação com biocerâmica ao nível da câmara pulpar, vidro ionomérico para proteger a biocerâmica e posteriormente resina composta para restaurar o dente.

Avaliação clínica pós-implantação de EMF

1. Os controles clínicos (avaliação facial, avaliação gengival, palpação apical, percussão horizontal e vertical, testes de sensibilidade ao frio e ao calor) serão realizados nos dias 0, 7, 30, 90, 180 e 364. Adicionalmente, uma avaliação clínica será realizada dois anos após a implantação do EMC.
2. Os controles radiológicos serão realizados nos dias 0, 7, 30, 90, 180 e 364. Adicionalmente, serão realizados dois anos após a implantação de células estromais mesenquimais.
3. Uma avaliação tomográfica será realizada quando o reparo periapical for evidente em uma radiografia periapical.