Allogeenisen MSC:n siirto potilailla, joilla on pulpan nekroosi ja krooninen apikaalinen parodontiitti (MSC)

Tässä tutkimuksessa mukana olevien potilaiden endodonttinen toimenpide keskittyy pulpan nekroositapauksiin, joissa esiintyy apikaalista parodontiittia ilman merkkejä infektioprosesseista.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT. Reagenssit Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu ihmisen erilaistumisantigeenejä (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166) vastaan, konjugoituina fluoreseiini-isotiosyanaattiin (CFI) tai fykoerytriiniin (PE) ostettiin yhtiöltä BDUS Bioscience.

Ihmisen luuytimestä saatujen mesenkymaalisten stroomasolujen (MSC) eristäminen ja viljely. Tässä tutkimuksessa käytetään eristettyjä EMF:itä luuytimestä (BM) potilailta, joilla on diagnosoitu posttraumaattinen liitos (luuliitoksen epäonnistuminen murtumakohdissa). Nämä solut siirrettiin pseudoartroosikohtaan luun regeneraation indusoimiseksi näissä potilaissa. Protokolla luun regeneroimiseksi EMF-siirron avulla suoritettiin Caracasin yliopistollisessa sairaalassa, Hospital Universitario de Los Andesissa, Hospital Pérez de León II:ssa, ja sillä on kunkin laitoksen ja jokaisen potilaan bioetiikkakomitean hyväksyntä tietoisen suostumuksen perusteella. Tässä protokollassa jokaisen potilaan BM eristettiin lonkkaharjanteen pistolla. Tämä toimenpide suoritettiin leikkaussalissa, nukutuksessa ja erikoislääkärin toimesta. MO-aspiraatti asetettiin alfa-MEM-elatusaineeseen (Invitrogen, USA) hepariinin kanssa (Sanofi Aventis). Mononukleaariset solut erotettiin sentrifugoimalla Ficoll-Hypaque-gradientilla (GE Healthcare, Ruotsi) ja viljeltiin alfa-MEM-Chang-elatusaineessa (Irvine Scientific, USA), joka oli rikastettu 20 % autologisella seerumilla. Näitä soluja pidettiin viljelmässä kontrolloidussa ympäristössä 37 ºC:ssa ja 5 % CO2:ssa. 72 tunnin kuluttua ei-adherentit solut poistettiin ja perusviljelyväliaine (alfa-MEM-Chang / 20 % autologinen seerumi) lisättiin. Niiden tarttuminen muoviin eristi MSC:t. Viljelyalustan vaihtoja tehtiin, kunnes saavutettiin yhtymäkohta lähellä 70-80 %. MSC:t laajennettiin kuorimalla viljelmät edellä kuvattua prosessia noudattaen. Mikrobiologiset tutkimukset suoritettiin BM:n saamisen jälkeen ja ennen MSC-istutuksen suorittamista. MSC:n käytön jälkeen erä näistä soluista kylmäsäilytettiin -70 °C:ssa.

MSC:n fenotyyppinen karakterisointi. MSC:n fenotyyppiset karakterisointitutkimukset suoritettiin virtaussytometrialla. Jolle kiinnittyneet MO-solut irrotettiin viljelypullosta käyttämällä trypsiinin kaltaisia ​​entsyymejä. Sen jälkeen soluja inkuboitiin MSC-markkereille (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 ja CD49b) ja hematopoieettisille (CD34, CD45 ja CD14) spesifisten vasta-aineiden kanssa. Ekspressiomarkkerien sytometrinen analyysi osoitti, että 100 % kussakin potilaassa transplantaatioon käytetyistä soluista oli MSC:tä.

MSC:n erilaistumistutkimukset. MSC:iden monipotentiaalista erilaistumiskykyä tutkittiin viljelemällä näitä soluja osteogeenisissä, kondrogeenisissa ja adipogeenisissa erilaistumisalustassa noudattaen aiemmin kuvattua menetelmää. Lyhyesti sanottuna MSC:t irrotettiin ja kylvettiin 24-kuoppaisille viljelylevyille solutiheydellä 5 x 104 kuoppaa kohti, jatkettiin vastaavan erilaistumisväliaineen lisäämistä. Osteogeenistä erilaistumista varten MSC:itä viljeltiin deksametasonilla (100 nM, Biotech), askorbiinihapolla (10 mM, Sigma), epäorgaanisella fosfaatilla (1,8 mM, Merck) ja beetaglyserolifosfaatilla (2 mM, Sigma) rikastetun peruselatusaineen läsnä ollessa. Kondrogeenista erilaistumista varten soluja viljeltiin kaupallisessa kondrosyyttien alustassa (Cell Application, USA) ja erilaistumiseen kohti adipogeenistä linjaa käytettiin kaupallista elatusainetta NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA). Kaikissa tapauksissa soluja pidettiin viljelmässä 21 - 28 päivää väliainevaihdolla 4 - 5 päivän välein. Erilaistumisprosessiin liittyvien muutosten osoittamiseksi solut kiinnitettiin käyttämällä paraformaldehydiä (Merck, USA) ja kullekin tapaukselle suoritettiin spesifiset värjäykset. Lyhyesti sanottuna, alizariininpunainen havaitsemaan kalsiumin kertymistä (todiste osteogeneesistä), Alcian sininen havaitsemaan proteoglykaaneja (todiste kondrogeneesista) ja öljynpunainen (Oil Red) havaitsemaan lipidejä (todiste adipogeneesistä). Kaikissa tapauksissa suoritettiin mikroskooppinen havainto ja valokuvarekisteröinti. Endoteelin erilaistumista (CEn) varten EMF:itä viljeltiin MCDB 131 -elatusaineessa (Invitrogen, USA), joka oli rikastettu 10 % autologisella seerumilla, 10 µg/ml ihmisen epidermaalista kasvutekijää (hu-EGF, R&D) ja hydrokortisonia (1 µg/ml, Sigma). .

MSC-istutus potilaille, joilla on pulpan nekroosi ja apikaalinen parodontiitti. Kaikki MSC-käsittelytoimenpiteet suoritetaan IVIC-soluterapiayksikön puhdastilassa hyvän valmistustavan (GMP) standardien mukaisesti. Allogeenistä BM-MSC:tä potilailta, joilla on diagnosoitu posttraumaattinen yhteenliittyminen ja joita on hoidettu näiden solujen implantoinnilla, käytetään luun regeneraation indusoimiseen. Tässä protokollassa käytettävät MSC:t on aiemmin karakterisoitu fenotyyppisesti ja toiminnallisesti. MSC sulatetaan, kasvatetaan ja laajennetaan aiemmin kuvatulla tavalla. Osa soluista säilytetään MSC:ille tarkoitetussa elatusaineessa, ja toista osaa viljellään endoteelin erilaistumisväliaineessa (CEM-Endo). Kun tarvittava määrä MSC- ja MSC-Endo-soluja on saavutettu, näiden solujen suspensio (75 000 solua kustakin) laitetaan steriileihin viljelyputkiin, jotka sisältävät DMEM-F12-viljelyalustaa, ilman fenolipunaista, täydennettynä 20 % autologisella liuoksella. seerumi. Jokainen MSC/MSC-Endoa sisältävä putki kuljetetaan pienessä biologisen näytteen kuljetuskellarissa huoneenlämmössä Instituto Venezolano de Investigaciones Científicasin (IVIC) hammaslääketieteelliseen palveluun.

Steriileissä olosuhteissa potilas nukutetaan paikallisesti vaurioituneelle hampaan alueelle; vaurioituneen hampaan juurikanava paljastetaan ja valmistetaan suorittamaan MSC/MSC-Endo/PRP-implantti. Samanaikaisesti viljelyalustan supernatantti poistetaan kustakin putkesta ja CEM/CEM-Endo "painike (pelletti)" suspendoidaan uudelleen autologiseen verihiutalerikkaaseen plasmaan (PRP). Tämän jälkeen MSC/Endo/PRP-suspensioon lisätään 5 % CaCl2:ta ja trombiinia. Välittömästi ja ennen hyytymän muodostumista 20 mikrolitraa CEM/CEM-Endo/PRP-suspensiota laitetaan juurikanavaan, peitettynä kollageenikalvolla. Myöhemmin obturaatiomenettely biokeramiikalla suoritetaan massakammion, ionomeerisen lasin tasolla biokeraamin suojaamiseksi ja myöhemmin komposiittihartsin tasolla hampaan palauttamiseksi.

EMF:n kliininen arviointi implantaation jälkeen

1. Kliiniset kontrollit (kasvojen arviointi, ienten arviointi, apikaalinen tunnustelu, vaaka- ja pystysuunnassa lyöminen, kylmä- ja lämpöherkkyystestit) suoritetaan päivinä 0, 7, 30, 90, 180 ja 364. Lisäksi kliininen arviointi suoritetaan kahden vuoden kuluttua EMC-istutuksesta.
2. Radiologiset tarkastukset suoritetaan päivinä 0, 7, 30, 90, 180 ja 364. Lisäksi ne suoritetaan kaksi vuotta mesenkymaalisten stroomasolujen istutuksen jälkeen.
3. Tomografinen arviointi suoritetaan, kun periapikaalinen korjaus näkyy periapikaalisessa röntgenkuvassa.