Trasplante de CMM alogénicas en pacientes con necrosis pulpar y periodontitis apical crónica (MSC)

El procedimiento endodóntico en los pacientes incluidos en este estudio se centrará en casos de necrosis pulpar con periodontitis apical sin evidencia de procesos infecciosos.

MATERIALES Y MÉTODOS. Reactivos Los anticuerpos monoclonales murinos, dirigidos contra antígenos de diferenciación humanos (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), conjugados con isotiocianato de fluoresceína (CFI) o ficoeritrina (PE) se adquirieron de BD Biosciences (EE. UU.).

Aislamiento y cultivo de células estromales mesenquimales (MSC) obtenidas de médula ósea humana. En el presente estudio, se utilizarán campos electromagnéticos aislados de médula ósea (MO) de pacientes con diagnóstico de pseudoartrosis postraumática (falta de unión ósea en los sitios de fractura). Estas células fueron trasplantadas en el sitio de pseudoartrosis para inducir la regeneración ósea en estos pacientes. El protocolo de regeneración ósea mediante trasplante de CEM se realizó en el Hospital Universitario de Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II y cuenta con la aprobación de los Comités de Bioética de cada institución y de cada paciente mediante consentimiento informado. En este protocolo se aisló la MO de cada paciente mediante una punción en la cresta ilíaca. Este procedimiento se realizó en quirófano, bajo anestesia y por un médico especialista. El aspirado de MO se colocó en medio alfa-MEM (Invitrogen, EE. UU.) con heparina (Sanofi Aventis). Las células mononucleares se separaron por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Suecia) y se cultivaron en medio alfa-MEM-Chang (Irvine Scientific, EE. UU.) enriquecido con suero autólogo al 20%. Estas células se mantuvieron en cultivo en un ambiente controlado a 37ºC y 5% de CO2. A las 72 horas se eliminaron las células no adherentes y se añadió un medio de cultivo basal (alfa-MEM-Chang/20% suero autólogo). Su adherencia al plástico aisló las MSC. Se realizaron intercambios de medio de cultivo hasta alcanzar una confluencia cercana al 70-80%. Las MSC se expandieron pelando los cultivos, siguiendo el proceso descrito anteriormente. Los exámenes microbiológicos se realizaron después de obtener la MO y antes de realizar la implantación de las MSC. Después de usar MSC, se crioconservó un lote de estas células a -70 -C.

Caracterización fenotípica de MSC. Los estudios de caracterización fenotípica de MSC se llevaron a cabo mediante citometría de flujo. Para lo cual las células adherentes a MO se separaron del matraz de cultivo utilizando enzimas similares a la tripsina. Posteriormente, las células se incubaron con anticuerpos específicos para los marcadores MSC (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 y CD49b) y hematopoyéticos (CD34, CD45 y CD14). El análisis citométrico de los marcadores de expresión mostró que el 100 % de las células utilizadas para el trasplante en cada paciente eran MSC.

Estudios de diferenciación de MSC. La capacidad de diferenciación multipotencial de las MSC se examinó cultivando estas células en medios de diferenciación osteogénicos, condrogénicos y adipogénicos, siguiendo una metodología similar a la descrita anteriormente. Brevemente, las MSC se desprendieron y sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos a una densidad celular de 5x104 por pocillo, procediendo a añadir el medio de diferenciación correspondiente. Para la diferenciación osteogénica, las MSC se cultivaron en presencia de medio basal enriquecido con dexametasona (100 nM, Biotech), ácido ascórbico (10 mM, Sigma), fosfato inorgánico (1,8 mM, Merck) y beta-glicerol fosfato (2 mM, Sigma). Para la diferenciación condrogénica, las células se cultivaron en un medio comercial para condrocitos (Cell Application, EE. UU.) y para la diferenciación hacia el linaje adipogénico se utilizó el medio comercial NH Adipodiff Human (Miltenyi, EE. UU.). En todos los casos, las células se mantuvieron en cultivo durante 21-28 días con cambios de medio cada 4-5 días. Para demostrar los cambios asociados al proceso de diferenciación, las células se fijaron con paraformaldehído (Merck, EE. UU.) y se realizaron tinciones específicas para cada caso. Brevemente, rojo de alizarina para detectar depósitos de calcio (evidencia de osteogénesis), azul de Alcian para detectar proteoglicanos (evidencia de condrogénesis) y rojo de aceite (Oil Red) para ver lípidos (evidencia de adipogénesis). En todos los casos se realizó observación microscópica y registro fotográfico. Para la diferenciación endotelial (CEn), los EMF se cultivaron en medio MCDB 131 (Invitrogen, EE. UU.) enriquecido con suero autólogo al 10 %, 10 µg/ml de factor de crecimiento epidérmico humano (hu-EGF, R&D) e hidrocortisona (1 µg/ml, Sigma) .

Implantación de MSC en pacientes con necrosis pulpar y periodontitis apical. Todos los procedimientos de procesamiento de MSC se realizarán en la sala limpia de la Unidad de Terapia Celular IVIC siguiendo las normas de buenas prácticas de fabricación (GMP). Se utilizarán BM-MSC alogénicas de pacientes diagnosticados con pseudoartrosis postraumática y tratados con implantación de estas células para inducir la regeneración ósea. El MSC que se utilizará en este protocolo se ha caracterizado previamente fenotípica y funcionalmente. El MSC será descongelado, cultivado y expandido como se describió anteriormente. Una parte de las células se mantendrá en un medio para MSC y otra parte se cultivará en medio de diferenciación endotelial (CEM-Endo). Una vez alcanzado el número requerido de MSCs y MSCs-Endo, se colocará una suspensión de estas células (75.000 células de cada una de ellas) en tubos de cultivo estériles que contengan medio de cultivo DMEM-F12, sin rojo fenol, suplementado con 20% de líquido autólogo. suero. Cada tubo que contenga MSC/MSC-Endo será transportado en una pequeña bodega de transporte de muestras biológicas, a temperatura ambiente, al Servicio de Odontología del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Bajo condiciones estériles, el paciente será anestesiado localmente en el área del diente afectado; se expondrá y preparará el conducto radicular del diente afectado para realizar el implante MSC/MSC-Endo/PRP. Al mismo tiempo, se retira el sobrenadante del medio de cultivo de cada tubo y el "botón (pellet)" de CEM/CEM-Endo se resuspende en plasma autólogo rico en plaquetas (PRP). Posteriormente a la suspensión de MSC/Endo/PRP se le añadirá CaCl2 al 5% y trombina. Inmediatamente, y antes de que se forme el coágulo, se colocarán 20 microlitros de la suspensión CEM/CEM-Endo/PRP en el conducto radicular, recubierto con una membrana de colágeno. Posteriormente se realizará el procedimiento de obturación con biocerámica a nivel de cámara pulpar, vidrio ionomérico para proteger la biocerámica y posteriormente resina compuesta para restaurar el diente.

Evaluación clínica posterior a la implantación de EMF

1. Los controles clínicos (evaluación facial, evaluación gingival, palpación apical, percusión horizontal y vertical, pruebas de sensibilidad al frío y al calor) se realizarán los días 0, 7, 30, 90, 180 y 364. Adicionalmente, se realizará una evaluación clínica a los dos años post-implantación de EMC.
2. Los controles radiológicos se realizarán los días 0, 7, 30, 90, 180 y 364. Además, se realizarán dos años después de la implantación de células estromales mesenquimales.
3. Se realizará una evaluación tomográfica cuando la reparación periapical sea evidente en una radiografía periapical.