Transplantasjon av allogen MSC hos pasienter med pulpa-nekrose og kronisk apikal periodontitt (MSC)

Den endodontiske prosedyren hos pasientene som er inkludert i denne studien vil fokusere på tilfeller av pulpa nekrose med apikal periodontitt uten tegn på infeksjonsprosesser.

MATERIALER OG METODER. Reagenser Murine monoklonale antistoffer, rettet mot humane differensieringsantigener (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), konjugert til fluorescein isothiocyanat (CFI) eller phycoerythrin (PE) ble kjøpt fra BD Biosciences (USA).

Isolering og kultur av mesenkymale stromale celler (MSC) hentet fra menneskelig benmarg. I denne studien vil isolerte EMF fra benmarg (BM) fra pasienter med diagnosen posttraumatisk nonunion (svikt i en benforening på fraktursteder) bli brukt. Disse cellene ble transplantert inn i pseudoartrosestedet for å indusere beinregenerering hos disse pasientene. Protokollen for beinregenerering gjennom EMF-transplantasjon ble utført ved Universitetssykehuset i Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II og har godkjenning fra bioetiske komiteer for hver institusjon og hver pasient gjennom informert samtykke. I denne protokollen ble BM til hver pasient isolert ved en punktering i hoftekammen. Denne prosedyren ble utført på operasjonsstuen, i narkose og av en lege. MO-aspiratet ble plassert i alfa-MEM-medium (Invitrogen, USA) med heparin (Sanofi Aventis). De mononukleære cellene ble separert ved sentrifugering på en Ficoll-Hypaque-gradient (GE Healthcare, Sverige) og dyrket i alfa-MEM-Chang-medium (Irvine Scientific, USA) beriket med 20 % autologt serum. Disse cellene ble holdt i kultur i et kontrollert miljø ved 37ºC og 5 % CO2. Etter 72 timer ble ikke-adherente celler eliminert, og et basalt kulturmedium (alfa-MEM-Chang / 20 % autologt serum) ble tilsatt. Deres tilslutning til plasten isolerte MSC-ene. Det ble foretatt utveksling av kulturmedium inntil man nådde en sammenløp nær 70-80%. MSC-ene ble utvidet ved å skrelle kulturene, etter prosessen beskrevet ovenfor. Mikrobiologiske undersøkelser ble utført etter innhenting av BM og før MSC-implantasjon. Etter bruk av MSC ble en batch av disse cellene kryokonservert ved -70 -C.

Fenotypisk karakterisering av MSC. Fenotypiske karakteriseringsstudier av MSC ble utført ved flowcytometri. For hvilke de MO-adherente cellene ble løsnet fra kulturkolben ved å bruke trypsinlignende enzymer. Deretter ble cellene inkubert med antistoffer spesifikke for MSC-markører (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 og CD49b) og hematopoetiske (CD34, CD45 og CD14). Cytometrisk analyse av ekspresjonsmarkørene viste at 100 % av cellene som ble brukt til transplantasjon i hver pasient var MSC.

MSC differensieringsstudier. Den multipotensiale differensieringskapasiteten til MSC-er ble undersøkt ved å dyrke disse cellene i osteogene, kondrogene og adipogene differensieringsmedier, etter en metodikk som ligner på den tidligere beskrevet. Kort fortalt ble MSC-ene løsnet og sådd i 24-brønners kulturplater med en celletetthet på 5x104 per brønn, og fortsatte med å tilsette det tilsvarende differensieringsmediet. For osteogen differensiering ble MSC-er dyrket i nærvær av basalt medium beriket med deksametason (100 nM, Biotech), askorbinsyre (10 mM, Sigma), uorganisk fosfat (1,8 mM, Merck) og beta-glyserolfosfat (2 mM, Sigma). For kondrogen differensiering ble celler dyrket i et kommersielt medium for kondrocytter (Cell Application, USA) og for differensiering mot den adipogene avstamningen ble det kommersielle mediet NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA) brukt. I alle tilfeller ble cellene holdt i kultur i 21-28 dager med mediumskift hver 4.-5. dag. For å demonstrere endringene knyttet til differensieringsprosessen, ble cellene fiksert ved bruk av paraformaldehyd (Merck, USA) og spesifikke farginger ble utført for hvert tilfelle. Kort fortalt, alizarin rød for å oppdage kalsiumavsetning (bevis på osteogenese), Alcian blå for å oppdage proteoglykaner (bevis på kondrogenese), og oljerød (oljerød) for å se lipider (bevis på adipogenese). I alle tilfeller ble det utført mikroskopisk observasjon og fotografisk registrering. For endoteldifferensiering (CEn) ble EMF dyrket i MCDB 131-medium (Invitrogen, USA) beriket med 10 % autologt serum, 10 µg/ml human epidermal vekstfaktor (hu-EGF, FoU) og hydrokortison (1µg/ml, Sigma) .

MSC-implantasjon hos pasienter med pulpa-nekrose og apikal periodontitt. Alle MSC-behandlingsprosedyrer vil bli utført i renrommet til IVIC-celleterapienheten i henhold til standardene for god produksjonspraksis (GMP). Allogen BM-MSC fra pasienter diagnostisert med posttraumatisk nonunion og behandlet med implantasjon av disse cellene vil bli brukt for å indusere beinregenerering. MSC som skal brukes i denne protokollen har tidligere vært fenotypisk og funksjonelt karakterisert. MSC vil bli tint, dyrket og utvidet som tidligere beskrevet. En del av cellene vil bli holdt i et medium for MSCs, og en annen del vil bli dyrket i endotelialt differensieringsmedium (CEM-Endo). Når det nødvendige antallet MSC-er og MSC-Endo er nådd, vil en suspensjon av disse cellene (75 000 celler fra hver av dem) bli plassert i sterile kulturrør som inneholder DMEM-F12-kulturmedium, uten fenolrødt, supplert med 20 % autologt serum. Hvert rør som inneholder MSC / MSC-Endo vil bli transportert i en liten biologisk prøvetransportkjeller, ved romtemperatur, til tannlegetjenesten til Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Under sterile forhold vil pasienten bli lokalbedøvet i det berørte tannområdet; rotkanalen til den berørte tannen vil bli eksponert og klargjort for å utføre MSC / MSC-Endo / PRP implantatet. Samtidig fjernes kulturmediesupernatanten fra hvert rør og CEM/CEM-Endo "knappen (pellet)" resuspenderes i autologt blodplaterikt plasma (PRP). Deretter til MSC / Endo / PRP-suspensjonen vil 5 % CaCl2 og trombin tilsettes. Umiddelbart, og før koaguleringen dannes, vil 20 mikroliter av CEM / CEM-Endo / PRP-suspensjonen plasseres i rotkanalen, dekket med en kollagenmembran. Deretter vil obturasjonsprosedyren med biokeramikk utføres på nivå med massekammeret, ionomert glass for å beskytte biokeramikken og senere komposittharpiks for å gjenopprette tannen.

Post-implantasjon klinisk evaluering av EMF

1. Kliniske kontroller (ansiktsevaluering, tannkjøttevaluering, apikal palpasjon, horisontal og vertikal perkusjon, kulde- og varmefølsomhetstester) vil bli utført på dag 0, 7, 30, 90, 180 og 364. I tillegg vil en klinisk evaluering bli utført de to årene etter implantasjon av EMC.
2. Radiologiske kontroller vil bli utført på dag 0, 7, 30, 90, 180 og 364. I tillegg vil de bli utført to år etter implantasjon av mesenkymale stromaceller.
3. En tomografisk evaluering vil bli utført når den periapikale reparasjonen vil være tydelig i et periapikalt røntgenbilde.