Transplantation de CSM allogéniques chez des patients atteints de nécrose pulpaire et de parodontite apicale chronique (MSC)

La procédure endodontique chez les patients inclus dans cette étude se concentrera sur les cas de nécrose pulpaire avec parodontite apicale sans preuve de processus infectieux.

MATÉRIELS ET MÉTHODES. Réactifs Des anticorps monoclonaux murins, dirigés contre les antigènes de différenciation humaine (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), conjugués à l'isothiocyanate de fluorescéine (CFI) ou à la phycoérythrine (PE) ont été achetés chez BD Biosciences (USA).

Isolement et culture de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) obtenues à partir de moelle osseuse humaine. Dans la présente étude, des champs électromagnétiques isolés de la moelle osseuse (MO) de patients présentant un diagnostic de pseudarthrose post-traumatique (échec d'une consolidation osseuse au niveau des sites de fracture) seront utilisés. Ces cellules ont été transplantées dans le site de la pseudarthrose pour induire la régénération osseuse chez ces patients. Le protocole de régénération osseuse par transplantation EMF a été réalisé à l'hôpital universitaire de Caracas, à l'hôpital universitaire de Los Andes, à l'hôpital Pérez de León II et a l'approbation des comités de bioéthique de chaque institution et de chaque patient par consentement éclairé. Dans ce protocole, le BM de chaque patient a été isolé par une ponction dans la crête iliaque. Cette intervention a été réalisée au bloc opératoire, sous anesthésie et par un médecin spécialiste. L'aspiration MO a été placée dans un milieu alpha-MEM (Invitrogen, USA) avec de l'héparine (Sanofi Aventis). Les cellules mononucléaires ont été séparées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Suède) et cultivées en milieu alpha-MEM-Chang (Irvine Scientific, USA) enrichi avec 20% de sérum autologue. Ces cellules ont été maintenues en culture dans un environnement contrôlé à 37°C et 5% de CO2. Après 72 heures, les cellules non adhérentes ont été éliminées, et un milieu de culture basal (alpha-MEM-Chang / 20% sérum autologue) a été ajouté. Leur adhérence au plastique a isolé les MSC. Des échanges de milieu de culture ont été effectués jusqu'à atteindre une confluence proche de 70-80%. Les MSC ont été expansés en épluchant les cultures, en suivant le processus décrit ci-dessus. Des examens microbiologiques ont été effectués après l'obtention du BM et avant de procéder à l'implantation du MSC. Après utilisation de MSC, un lot de ces cellules a été cryoconservé à -70 -C.

Caractérisation phénotypique des MSC. Des études de caractérisation phénotypique des MSC ont été réalisées par cytométrie en flux. Pour lequel les cellules adhérentes MO ont été détachées du flacon de culture en utilisant des enzymes de type trypsine. Par la suite, les cellules ont été incubées avec des anticorps spécifiques des marqueurs MSC (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 et CD49b) et hématopoïétiques (CD34, CD45 et CD14). L'analyse cytométrique des marqueurs d'expression a montré que 100% des cellules utilisées pour la transplantation chez chaque patient étaient des MSC.

Etudes de différenciation MSC. La capacité de différenciation multipotentielle des MSC a été examinée en cultivant ces cellules dans des milieux de différenciation ostéogéniques, chondrogéniques et adipogéniques, selon une méthodologie similaire à celle décrite précédemment. Brièvement, les MSC ont été détachées et ensemencées dans des plaques de culture 24 puits à une densité cellulaire de 5x104 par puits, en procédant à l'ajout du milieu de différenciation correspondant. Pour la différenciation ostéogénique, les CSM ont été cultivées en présence d'un milieu de base enrichi de dexaméthasone (100 nM, Biotech), d'acide ascorbique (10 mM, Sigma), de phosphate inorganique (1,8 mM, Merck) et de phosphate de bêta-glycérol (2 mM, Sigma). Pour la différenciation chondrogénique, les cellules ont été cultivées dans un milieu commercial pour chondrocytes (Cell Application, USA) et pour la différenciation vers la lignée adipogénique, le milieu commercial NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA) a été utilisé. Dans tous les cas, les cellules ont été maintenues en culture pendant 21 à 28 jours avec des changements de milieu tous les 4 à 5 jours. Pour démontrer les changements associés au processus de différenciation, les cellules ont été fixées à l'aide de paraformaldéhyde (Merck, USA) et des colorations spécifiques ont été réalisées pour chaque cas. En bref, le rouge alizarine pour détecter les dépôts de calcium (preuve de l'ostéogenèse), le bleu Alcian pour détecter les protéoglycanes (preuve de la chondrogenèse) et le rouge huile (Oil Red) pour voir les lipides (preuve de l'adipogenèse). Dans tous les cas, une observation microscopique et un recalage photographique ont été effectués. Pour la différenciation endothéliale (CEn), les champs électromagnétiques ont été cultivés dans du milieu MCDB 131 (Invitrogen, USA) enrichi avec 10% de sérum autologue, 10µg/ml de facteur de croissance épidermique humain (hu-EGF, R&D) et de l'hydrocortisone (1µg/ml, Sigma) .

Implantation de MSC chez des patients atteints de nécrose pulpaire et de parodontite apicale. Toutes les procédures de traitement MSC seront effectuées dans la salle blanche de l'unité de thérapie cellulaire IVIC conformément aux normes de bonnes pratiques de fabrication (BPF). Des BM-MSC allogéniques provenant de patients diagnostiqués avec une pseudarthrose post-traumatique et traités par implantation de ces cellules seront utilisées pour induire la régénération osseuse. Les MSC à utiliser dans ce protocole ont déjà été caractérisés phénotypiquement et fonctionnellement. Le MSC sera décongelé, développé et élargi comme décrit précédemment. Une partie des cellules sera conservée dans un milieu pour MSCs, et une autre partie sera cultivée dans un milieu de différenciation endothéliale (CEM-Endo). Une fois le nombre requis de MSCs et MSCs-Endo atteint, une suspension de ces cellules (75 000 cellules de chacune d'elles) sera placée dans des tubes de culture stériles contenant du milieu de culture DMEM-F12, sans rouge de phénol, additionné de 20% d'autologue sérum. Chaque tube contenant du MSC / MSC-Endo sera transporté dans une petite cave de transport d'échantillons biologiques, à température ambiante, au service de dentisterie de l'Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Dans des conditions stériles, le patient sera anesthésié localement dans la zone dentaire affectée ; le canal radiculaire de la dent affectée sera exposé et préparé pour réaliser l'implant MSC / MSC-Endo / PRP. Dans le même temps, le surnageant du milieu de culture est retiré de chaque tube et le "bouton (pastille)" CEM/CEM-Endo est remis en suspension dans du plasma riche en plaquettes (PRP) autologue. Par la suite à la suspension MSC/Endo/PRP, 5% de CaCl2 et de la thrombine seront ajoutés. Immédiatement, et avant la formation du caillot, 20 microlitres de la suspension CEM/CEM-Endo/PRP seront placés dans le canal radiculaire, recouvert d'une membrane de collagène. Par la suite, la procédure d'obturation avec de la biocéramique sera réalisée au niveau de la chambre pulpaire, du verre ionomère pour protéger la biocéramique et plus tard de la résine composite pour restaurer la dent.

Évaluation clinique post-implantation des CEM

1. Des contrôles cliniques (évaluation faciale, évaluation gingivale, palpation apicale, percussion horizontale et verticale, tests de sensibilité au froid et à la chaleur) seront effectués aux jours 0, 7, 30, 90, 180 et 364. De plus, une évaluation clinique sera effectuée deux ans après l'implantation d'EMC.
2. Des contrôles radiologiques seront effectués aux jours 0, 7, 30, 90, 180 et 364. De plus, elles seront réalisées deux ans après l'implantation de cellules stromales mésenchymateuses.
3. Une évaluation tomographique sera effectuée lorsque la réparation périapicale sera évidente sur une radiographie périapicale.