Trapianto di MSC allogeniche in pazienti con necrosi pulpare e parodontite apicale cronica (MSC)

La procedura endodontica nei pazienti inclusi in questo studio si concentrerà sui casi di necrosi pulpare con parodontite apicale senza evidenza di processi infettivi.

MATERIALI E METODI. Reagenti Anticorpi monoclonali murini, diretti contro antigeni di differenziazione umani (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), coniugati con isotiocianato di fluoresceina (CFI) o ficoeritrina (PE) sono stati acquistati da BD Biosciences (USA).

Isolamento e coltura di cellule stromali mesenchimali (MSC) ottenute da midollo osseo umano. Nel presente studio verranno utilizzati campi elettromagnetici isolati dal midollo osseo (BM) di pazienti con diagnosi di mancato consolidamento post-traumatico (fallimento di un'unione ossea nei siti di frattura). Queste cellule sono state trapiantate nel sito di pseudoartrosi per indurre la rigenerazione ossea in questi pazienti. Il protocollo per la rigenerazione ossea attraverso il trapianto di campi elettromagnetici è stato eseguito presso l'Ospedale Universitario di Caracas, Ospedale Universitario de Los Andes, Ospedale Pérez de León II e ha l'approvazione dei Comitati di Bioetica di ogni istituzione e di ogni paziente attraverso il consenso informato. In questo protocollo, il BM di ogni paziente è stato isolato da una puntura nella cresta iliaca. Questa procedura è stata eseguita in sala operatoria, in anestesia e da un medico specialista. L'aspirato MO è stato posto in mezzo alfa-MEM (Invitrogen, USA) con eparina (Sanofi Aventis). Le cellule mononucleate sono state separate mediante centrifugazione su gradiente Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Svezia) e coltivate in terreno alfa-MEM-Chang (Irvine Scientific, USA) arricchito con siero autologo al 20%. Queste cellule sono state mantenute in coltura in un ambiente controllato a 37ºC e 5% CO2. Dopo 72 ore, le cellule non aderenti sono state eliminate ed è stato aggiunto un terreno di coltura basale (alfa-MEM-Chang / 20% di siero autologo). La loro aderenza alla plastica ha isolato le MSC. Gli scambi di mezzo di coltura sono stati effettuati fino a raggiungere una confluenza prossima al 70-80%. Le MSC sono state ampliate pelando le colture, seguendo il processo sopra descritto. Gli esami microbiologici sono stati eseguiti dopo aver ottenuto il BM e prima di eseguire l'impianto di MSC. Dopo aver utilizzato MSC, un lotto di queste cellule è stato criopreservato a -70°C.

Caratterizzazione fenotipica delle MSC. Gli studi di caratterizzazione fenotipica delle MSC sono stati condotti mediante citometria a flusso. Per cui le cellule aderenti MO sono state staccate dal pallone di coltura utilizzando enzimi simili alla tripsina. Successivamente, le cellule sono state incubate con anticorpi specifici per marcatori MSC (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 e CD49b) ed emopoietici (CD34, CD45 e CD14). L'analisi citometrica dei marcatori di espressione ha mostrato che il 100% delle cellule utilizzate per il trapianto in ciascun paziente erano MSC.

Studi sulla differenziazione delle MSC. La capacità di differenziazione multipotenziale delle MSC è stata esaminata coltivando queste cellule in mezzi di differenziazione osteogenici, condrogenici e adipogenici, seguendo una metodologia simile a quella precedentemente descritta. In breve, le MSC sono state staccate e seminate in piastre di coltura da 24 pozzetti ad una densità cellulare di 5x104 per pozzetto, procedendo ad aggiungere il corrispondente mezzo di differenziazione. Per la differenziazione osteogenica, le MSC sono state coltivate in presenza di terreno basale arricchito con desametasone (100nM, Biotech), acido ascorbico (10mM, Sigma), fosfato inorganico (1,8mM, Merck) e beta-glicerolo fosfato (2mM, Sigma). Per la differenziazione condrogenica, le cellule sono state coltivate in un mezzo commerciale per condrociti (Cell Application, USA) e per la differenziazione verso il lignaggio adipogenico è stato utilizzato il mezzo commerciale NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA). In tutti i casi le cellule sono state mantenute in coltura per 21-28 giorni con cambi di terreno ogni 4-5 giorni. Per dimostrare i cambiamenti associati al processo di differenziazione, le cellule sono state fissate utilizzando paraformaldeide (Merck, USA) e sono state eseguite colorazioni specifiche per ciascun caso. In breve, rosso alizarina per rilevare la deposizione di calcio (prova di osteogenesi), blu Alcian per rilevare proteoglicani (prova di condrogenesi) e rosso petrolio (Oil Red) per vedere i lipidi (prova di adipogenesi). In tutti i casi è stata effettuata osservazione microscopica e registrazione fotografica. Per la differenziazione endoteliale (CEn), i campi elettromagnetici sono stati coltivati ​​in terreno MCDB 131 (Invitrogen, USA) arricchito con siero autologo al 10%, 10 µg/ml di fattore di crescita epidermico umano (hu-EGF, R&S) e idrocortisone (1 µg/ml, Sigma) .

Impianto di MSC in pazienti con necrosi pulpare e parodontite apicale. Tutte le procedure di elaborazione delle MSC saranno eseguite nella camera bianca dell'unità di terapia cellulare IVIC seguendo gli standard di buone pratiche di fabbricazione (GMP). BM-MSC allogeniche di pazienti con diagnosi di pseudoartrosi post-traumatica e trattati con l'impianto di queste cellule saranno utilizzate per indurre la rigenerazione ossea. Le MSC da utilizzare in questo protocollo sono state precedentemente caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente. Le MSC saranno scongelate, cresciute ed espanse come precedentemente descritto. Una parte delle cellule sarà conservata in un terreno per MSCs, e un'altra parte sarà coltivata in terreno di differenziamento endoteliale (CEM-Endo). Una volta raggiunto il numero richiesto di MSC e MSC-Endo, una sospensione di queste cellule (75.000 cellule per ciascuna di esse) verrà posta in provette di coltura sterili contenenti terreno di coltura DMEM-F12, senza rosso fenolo, addizionato con il 20% di autologo siero. Ogni provetta contenente MSC / MSC-Endo sarà trasportata in una piccola cantina per il trasporto di campioni biologici, a temperatura ambiente, al Servizio di odontoiatria dell'Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

In condizioni sterili, il paziente verrà anestetizzato localmente nella zona del dente interessata; il canale radicolare del dente interessato sarà esposto e preparato per eseguire l'impianto MSC/MSC-Endo/PRP. Allo stesso tempo, il surnatante del terreno di coltura viene rimosso da ciascuna provetta e il "bottone (pellet)" CEM/CEM-Endo viene risospeso in plasma autologo ricco di piastrine (PRP). Successivamente alla sospensione MSC/Endo/PRP verrà aggiunto il 5% di CaCl2 e trombina. Immediatamente, e prima che si formi il coagulo, 20 microlitri della sospensione CEM / CEM-Endo / PRP verranno inseriti nel canale radicolare, ricoperto da una membrana di collagene. Successivamente si eseguirà la procedura di otturazione con bioceramica a livello della camera pulpare, vetro ionomerico per proteggere la bioceramica e successivamente resina composita per restaurare il dente.

Valutazione clinica post-impianto dei campi elettromagnetici

1. I controlli clinici (valutazione facciale, valutazione gengivale, palpazione apicale, percussione orizzontale e verticale, test di sensibilità al freddo e al caldo) verranno effettuati nei giorni 0, 7, 30, 90, 180 e 364. Inoltre, verrà effettuata una valutazione clinica nei due anni successivi all'impianto di EMC.
2. I controlli radiologici saranno effettuati nei giorni 0, 7, 30, 90, 180 e 364. Inoltre, saranno eseguiti due anni dopo l'impianto di cellule stromali mesenchimali.
3. Una valutazione tomografica verrà eseguita quando la riparazione periapicale sarà evidente in una radiografia periapicale.