Transplantacja allogenicznego MSC u pacjentów z martwicą miazgi i przewlekłym zapaleniem przyzębia wierzchołkowego (MSC)

Postępowanie endodontyczne u pacjentów włączonych do niniejszej pracy będzie koncentrować się na przypadkach martwicy miazgi z zapaleniem przyzębia wierzchołkowego bez cech procesów infekcyjnych.

MATERIAŁY I METODY. Odczynniki Mysie przeciwciała monoklonalne, skierowane przeciwko ludzkim antygenom różnicowania (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), skoniugowane z izotiocyjanianem fluoresceiny (CFI) lub fikoerytryną (PE) zakupiono od BD Biosciences (USA).

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC) uzyskanych z ludzkiego szpiku kostnego. W niniejszym badaniu zostaną wykorzystane izolowane pola elektromagnetyczne ze szpiku kostnego (BM) od pacjentów z rozpoznaniem pourazowego braku zrostu (niezrost zrostu kostnego w miejscach złamania). Komórki te przeszczepiono do miejsca pseudoartrozy w celu wywołania regeneracji kości u tych pacjentów. Protokół regeneracji kości poprzez przeszczep EMF został przeprowadzony w Szpitalu Uniwersyteckim w Caracas, Szpitalu Universitario de Los Andes, Szpitalu Pérez de León II i uzyskał akceptację Komisji Bioetycznych każdej instytucji i każdego pacjenta poprzez świadomą zgodę. W tym protokole BM każdego pacjenta izolowano przez nakłucie w grzebieniu biodrowym. Zabieg ten wykonywany był na sali operacyjnej, w znieczuleniu przez lekarza specjalistę. Aspirat MO umieszczono w pożywce alfa-MEM (Invitrogen, USA) z heparyną (Sanofi Aventis). Komórki jednojądrzaste oddzielono przez wirowanie na gradiencie Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Szwecja) i hodowano w pożywce alfa-MEM-Chang (Irvine Scientific, USA) wzbogaconej 20% autologicznej surowicy. Komórki te hodowano w kontrolowanym środowisku w temperaturze 37ºC i 5% CO2. Po 72 godzinach komórki nieprzylegające zostały wyeliminowane i dodano podstawową pożywkę hodowlaną (alfa-MEM-Chang / 20% surowica autologiczna). Ich przyleganie do plastiku izolowało MSC. Wymiany pożywek hodowlanych prowadzono aż do osiągnięcia konfluencji bliskiej 70-80%. MSC namnożono przez obieranie kultur, zgodnie z procesem opisanym powyżej. Badania mikrobiologiczne wykonano po pobraniu BM i przed wykonaniem implantacji MSC. Po użyciu MSC partię tych komórek poddano kriokonserwacji w temperaturze -70°C.

Charakterystyka fenotypowa MSC. Badania charakterystyki fenotypowej MSC przeprowadzono metodą cytometrii przepływowej. Dla których komórki adherentne MO oddzielono od kolby hodowlanej za pomocą enzymów podobnych do trypsyny. Następnie komórki inkubowano z przeciwciałami specyficznymi dla markerów MSC (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 i CD49b) oraz hematopoetycznych (CD34, CD45 i CD14). Analiza cytometryczna markerów ekspresji wykazała, że ​​100% komórek użytych do przeszczepu u każdego pacjenta to MSC.

Badania różnicowania MSC. Zdolność multipotencjalnego różnicowania MSC zbadano przez hodowanie tych komórek w pożywkach do różnicowania osteogennego, chondrogennego i adipogennego, zgodnie z metodologią podobną do opisanej wcześniej. W skrócie, MSC oddzielono i wysiano na 24-studzienkowych płytkach hodowlanych przy gęstości komórek 5x104 na studzienkę, po czym dodano odpowiednią pożywkę do różnicowania. W celu różnicowania osteogennego MSC hodowano w obecności pożywki podstawowej wzbogaconej deksametazonem (100 nM, Biotech), kwasem askorbinowym (10 mM, Sigma), fosforanem nieorganicznym (1,8 mM, Merck) i fosforanem beta-glicerolu (2 mM, Sigma). Do różnicowania chondrogennego komórki hodowano w komercyjnej pożywce dla chondrocytów (Cell Application, USA), a do różnicowania w kierunku linii adipogennej zastosowano handlową pożywkę NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA). We wszystkich przypadkach komórki hodowano przez 21-28 dni, zmieniając pożywkę co 4-5 dni. Aby zademonstrować zmiany związane z procesem różnicowania, komórki utrwalono za pomocą paraformaldehydu (Merck, USA) i dla każdego przypadku wykonano specyficzne barwienia. W skrócie, czerwień alizarynowa do wykrywania odkładania się wapnia (dowód na osteogenezę), błękit Alcian do wykrywania proteoglikanów (dowód na chondrogenezę) i czerwień olejowa (czerwień olejowa) do wykrywania lipidów (dowód na adipogenezę). We wszystkich przypadkach przeprowadzono obserwację mikroskopową i rejestrację fotograficzną. W celu różnicowania śródbłonka (CEn), pola elektromagnetyczne hodowano w podłożu MCDB 131 (Invitrogen, USA) wzbogaconym 10% autologiczną surowicą, 10 µg/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (hu-EGF, R&D) i hydrokortyzonem (1 µg/ml, Sigma) .

Implantacja MSC u pacjentów z martwicą miazgi i zapaleniem przyzębia wierzchołkowego. Wszystkie procedury przetwarzania MSC będą przeprowadzane w pomieszczeniu czystym Oddziału Terapii Komórkowej IVIC zgodnie ze standardami dobrej praktyki wytwarzania (GMP). Allogeniczny BM-MSC pobrany od pacjentów z rozpoznaniem pourazowego braku zrostu i leczonych implantacją tych komórek zostanie wykorzystany do indukcji regeneracji kości. MSC do zastosowania w tym protokole zostały wcześniej scharakteryzowane fenotypowo i funkcjonalnie. MSC będzie rozmrażany, hodowany i namnażany, jak opisano wcześniej. Część komórek będzie przechowywana w pożywce dla MSC, a część będzie hodowana w pożywce do różnicowania śródbłonka (CEM-Endo). Po osiągnięciu wymaganej liczby MSC i MSC-Endo zawiesina tych komórek (75 000 komórek z każdej z nich) zostanie umieszczona w sterylnych probówkach hodowlanych zawierających pożywkę hodowlaną DMEM-F12, bez czerwieni fenolowej, uzupełnioną 20% autologicznym serum. Każda probówka zawierająca MSC / MSC-Endo zostanie przetransportowana w małej piwnicy do transportu próbek biologicznych, w temperaturze pokojowej, do Służby Stomatologicznej Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

W sterylnych warunkach pacjent zostanie znieczulony miejscowo w dotkniętym obszarze zęba; kanał korzeniowy chorego zęba zostanie odsłonięty i przygotowany do wykonania implantu MSC/MSC-Endo/PRP. W tym samym czasie supernatant pożywki hodowlanej usuwa się z każdej probówki, a „guzik (pellet)” CEM / CEM-Endo ponownie zawiesza się w autologicznym osoczu bogatopłytkowym (PRP). Następnie do zawiesiny MSC/Endo/PRP zostanie dodany 5% CaCl2 i trombina. Bezpośrednio przed powstaniem skrzepu, do kanału korzeniowego, pokrytego membraną kolagenową, zostanie wprowadzone 20 mikrolitrów zawiesiny CEM/CEM-Endo/PRP. Następnie zostanie przeprowadzony zabieg wypełnienia bioceramiką na poziomie komory miazgi, szkłem jonomerowym do ochrony bioceramiki a później żywicą kompozytową do odbudowy zęba.

Kliniczna ocena pola elektromagnetycznego po implantacji

1. Kontrole kliniczne (ocena twarzy, ocena dziąseł, badanie palpacyjne koniuszka, opukiwanie poziome i pionowe, testy wrażliwości na zimno i ciepło) zostaną przeprowadzone w dniach 0, 7, 30, 90, 180 i 364. Dodatkowo zostanie przeprowadzona ocena kliniczna po dwóch latach od wszczepienia EMC.
2. Kontrole radiologiczne zostaną przeprowadzone w dniach 0, 7, 30, 90, 180 i 364. Dodatkowo zostaną przeprowadzone dwa lata po wszczepieniu mezenchymalnych komórek zrębowych.
3. Ocena tomograficzna zostanie przeprowadzona, gdy naprawa okołowierzchołkowa będzie widoczna na radiogramie okołowierzchołkowym.