Transplantation allogener MSC bei Patienten mit Pulpanekrose und chronischer apikaler Parodontitis (MSC)

Das endodontische Vorgehen bei den in diese Studie eingeschlossenen Patienten wird sich auf Fälle von Pulpanekrose mit apikaler Parodontitis ohne Nachweis infektiöser Prozesse konzentrieren.

MATERIALEN UND METHODEN. Reagenzien Murine monoklonale Antikörper, gerichtet gegen humane Differenzierungsantigene (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), konjugiert an Fluoresceinisothiocyanat (CFI) oder Phycoerythrin (PE), wurden von BD Biosciences (USA) bezogen.

Isolierung und Kultur von mesenchymalen Stromazellen (MSC), die aus menschlichem Knochenmark gewonnen wurden. In der vorliegenden Studie werden isolierte EMFs aus Knochenmark (BM) von Patienten mit der Diagnose einer posttraumatischen Pseudarthrose (Versagen einer Knochenvereinigung an Frakturstellen) verwendet. Diese Zellen wurden in die Pseudarthrosestelle transplantiert, um bei diesen Patienten eine Knochenregeneration zu induzieren. Das Protokoll zur Knochenregeneration durch EMF-Transplantation wurde am Universitätskrankenhaus von Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II durchgeführt und hat die Zustimmung der Bioethik-Kommissionen jeder Institution und jedes Patienten durch Einverständniserklärung. In diesem Protokoll wurde der BM jedes Patienten durch eine Punktion im Beckenkamm isoliert. Dieser Eingriff wurde im Operationssaal unter Narkose und von einem Facharzt durchgeführt. Das MO-Aspirat wurde in alpha-MEM-Medium (Invitrogen, USA) mit Heparin (Sanofi Aventis) gegeben. Die mononukleären Zellen wurden durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten (GE Healthcare, Schweden) abgetrennt und in mit 20 % autologem Serum angereichertem alpha-MEM-Chang-Medium (Irvine Scientific, USA) kultiviert. Diese Zellen wurden in einer kontrollierten Umgebung bei 37 °C und 5 % CO2 in Kultur gehalten. Nach 72 Stunden wurden nicht adhärente Zellen eliminiert und ein basales Kulturmedium (alpha-MEM-Chang / 20 % autologes Serum) zugegeben. Ihre Haftung am Kunststoff isolierte die MSCs. Kulturmediumaustausche wurden durchgeführt, bis eine Konfluenz nahe 70–80 % erreicht wurde. Die MSCs wurden durch Schälen der Kulturen nach dem oben beschriebenen Verfahren expandiert. Mikrobiologische Untersuchungen wurden nach Erhalt des BM und vor Durchführung der MSC-Implantation durchgeführt. Nach der Verwendung von MSC wurde eine Charge dieser Zellen bei -70 °C kryokonserviert.

Phänotypische Charakterisierung von MSC. Phänotypische Charakterisierungsstudien von MSC wurden durch Durchflusszytometrie durchgeführt. Dafür wurden die MO-adhärenten Zellen unter Verwendung von Trypsin-ähnlichen Enzymen von der Kulturflasche abgelöst. Anschließend wurden die Zellen mit Antikörpern inkubiert, die für MSC-Marker (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 und CD49b) und hämatopoetische (CD34, CD45 und CD14) spezifisch sind. Die zytometrische Analyse der Expressionsmarker zeigte, dass 100 % der für die Transplantation verwendeten Zellen bei jedem Patienten MSC waren.

Studien zur MSC-Differenzierung. Die multipotenzielle Differenzierungskapazität von MSCs wurde untersucht, indem diese Zellen in osteogenen, chondrogenen und adipogenen Differenzierungsmedien kultiviert wurden, wobei eine Methodik befolgt wurde, die der zuvor beschriebenen ähnlich war. Kurz gesagt, die MSCs wurden abgelöst und in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen bei einer Zelldichte von 5 × 10 4 pro Vertiefung ausgesät, wobei mit der Zugabe des entsprechenden Differenzierungsmediums fortgefahren wurde. Zur osteogenen Differenzierung wurden MSCs in Gegenwart von mit Dexamethason (100 nM, Biotech), Ascorbinsäure (10 mM, Sigma), anorganischem Phosphat (1,8 mM, Merck) und Beta-Glycerolphosphat (2 mM, Sigma) angereichertem Basalmedium kultiviert. Zur chondrogenen Differenzierung wurden Zellen in einem kommerziellen Medium für Chondrozyten (Cell Application, USA) kultiviert und zur Differenzierung in Richtung der adipogenen Linie wurde das kommerzielle Medium NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA) verwendet. In allen Fällen wurden die Zellen 21–28 Tage in Kultur gehalten, wobei das Medium alle 4–5 Tage gewechselt wurde. Um die mit dem Differenzierungsprozess verbundenen Veränderungen zu demonstrieren, wurden die Zellen unter Verwendung von Paraformaldehyd (Merck, USA) fixiert und für jeden Fall spezifische Färbungen durchgeführt. Kurz gesagt, Alizarinrot zum Nachweis von Calciumablagerung (Beweis für Osteogenese), Alcianblau zum Nachweis von Proteoglykanen (Beweis für Chondrogenese) und Ölrot (Oil Red) zum Erkennen von Lipiden (Beweis für Adipogenese). In allen Fällen wurden eine mikroskopische Beobachtung und eine fotografische Registrierung durchgeführt. Für die endotheliale Differenzierung (CEn) wurden EMFs in MCDB 131-Medium (Invitrogen, USA) kultiviert, das mit 10 % autologem Serum, 10 µg/ml humanem epidermalem Wachstumsfaktor (hu-EGF, R&D) und Hydrocortison (1 µg/ml, Sigma) angereichert war. .

MSC-Implantation bei Patienten mit Pulpanekrose und apikaler Parodontitis. Alle MSC-Verarbeitungsverfahren werden im Reinraum der IVIC-Zelltherapieeinheit gemäß den Standards der guten Herstellungspraxis (GMP) durchgeführt. Allogene BM-MSC von Patienten, bei denen eine posttraumatische Pseudarthrose diagnostiziert wurde und die mit einer Implantation dieser Zellen behandelt wurden, werden verwendet, um die Knochenregeneration zu induzieren. Die in diesem Protokoll zu verwendenden MSC wurden zuvor phänotypisch und funktionell charakterisiert. Die MSC wird wie zuvor beschrieben aufgetaut, gezüchtet und expandiert. Ein Teil der Zellen wird in einem Medium für MSCs gehalten und ein anderer Teil wird in Endothel-Differenzierungsmedium (CEM-Endo) kultiviert. Sobald die erforderliche Anzahl an MSCs und MSCs-Endo erreicht ist, wird eine Suspension dieser Zellen (jeweils 75.000 Zellen) in sterile Kulturröhrchen gegeben, die DMEM-F12-Kulturmedium ohne Phenolrot, ergänzt mit 20 % autologem, enthalten Serum. Jedes Röhrchen mit MSC / MSC-Endo wird in einem kleinen Transportkeller für biologische Proben bei Raumtemperatur zum zahnärztlichen Dienst des Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) transportiert.

Unter sterilen Bedingungen wird der Patient im betroffenen Zahnbereich lokal betäubt; Der Wurzelkanal des betroffenen Zahns wird freigelegt und für die Durchführung der MSC-/MSC-Endo-/PRP-Implantation vorbereitet. Gleichzeitig wird der Überstand des Kulturmediums aus jedem Röhrchen entfernt und der CEM/CEM-Endo „Knopf (Pellet)“ in autologem plättchenreichem Plasma (PRP) resuspendiert. Anschließend werden der MSC/Endo/PRP-Suspension 5 % CaCl2 und Thrombin zugesetzt. Unmittelbar und bevor sich das Gerinnsel bildet, werden 20 Mikroliter der CEM / CEM-Endo / PRP-Suspension in den Wurzelkanal eingebracht und mit einer Kollagenmembran bedeckt. Anschließend wird das Obturationsverfahren mit Biokeramik auf der Höhe der Pulpakammer, ionomerem Glas zum Schutz der Biokeramik und später mit Kompositharz zur Wiederherstellung des Zahns durchgeführt.

Klinische Bewertung von EMF nach der Implantation

1. An den Tagen 0, 7, 30, 90, 180 und 364 werden klinische Kontrollen (Gesichtsbeurteilung, Gingivabeurteilung, apikale Palpation, horizontale und vertikale Perkussion, Kälte- und Hitzeempfindlichkeitstests) durchgeführt. Zusätzlich wird zwei Jahre nach der Implantation von EMC eine klinische Bewertung durchgeführt.
2. Radiologische Kontrollen werden an den Tagen 0, 7, 30, 90, 180 und 364 durchgeführt. Zusätzlich werden sie zwei Jahre nach der Implantation mesenchymaler Stromazellen durchgeführt.
3. Eine tomographische Untersuchung wird durchgeführt, wenn die periapikale Reparatur in einer periapikalen Röntgenaufnahme offensichtlich ist.