Transplantation av allogen MSC hos patienter med pulpanekros och kronisk apikal parodontit (MSC)

Den endodontiska proceduren hos patienterna som ingår i denna studie kommer att fokusera på fall av pulpa nekros med apikal parodontit utan tecken på infektionsprocesser.

MATERIAL OCH METODER. Reagens Murina monoklonala antikroppar, riktade mot humana differentieringsantigener (CD34, CD45, CD14, CD90, CD73, CD29, CD49b, CD166), konjugerade till fluoresceinisotiocyanat (CFI) eller fykoerytrin (PE) köptes från BD Biosciences (USA).

Isolering och odling av mesenkymala stromaceller (MSC) erhållna från mänsklig benmärg. I den aktuella studien kommer isolerade EMF från benmärg (BM) från patienter med diagnosen posttraumatisk nonunion (misslyckande av en benförening vid frakturställen) att användas. Dessa celler transplanterades till pseudoartrosstället för att inducera benregenerering hos dessa patienter. Protokollet för benregenerering genom EMF-transplantation utfördes vid University Hospital of Caracas, Hospital Universitario de Los Andes, Hospital Pérez de León II och har godkännande av bioetiska kommittéer för varje institution och varje patient genom informerat samtycke. I detta protokoll isolerades BM hos varje patient genom en punktering i höftbenskammen. Denna procedur utfördes på operationssalen, under narkos och av en medicinsk specialist. MO-aspiratet placerades i alfa-MEM-medium (Invitrogen, USA) med heparin (Sanofi Aventis). De mononukleära cellerna separerades genom centrifugering på en Ficoll-Hypaque-gradient (GE Healthcare, Sverige) och odlades i alfa-MEM-Chang-medium (Irvine Scientific, USA) berikat med 20 % autologt serum. Dessa celler hölls i kultur i en kontrollerad miljö vid 37ºC och 5% CO2. Efter 72 timmar eliminerades icke-vidhäftande celler och ett basalt odlingsmedium (alfa-MEM-Chang / 20 % autologt serum) tillsattes. Deras vidhäftning till plasten isolerade MSC:erna. Utbyten av odlingsmedium gjordes tills de nådde ett sammanflöde nära 70-80 %. MSC:erna utökades genom att skala kulturerna, enligt den process som beskrivs ovan. Mikrobiologiska undersökningar utfördes efter att ha erhållit BM och innan MSC-implantationen utfördes. Efter användning av MSC, kryokonserverades en sats av dessa celler vid -70 -C.

Fenotypisk karakterisering av MSC. Fenotypiska karakteriseringsstudier av MSC utfördes med flödescytometri. För vilka de MO-vidhäftande cellerna lossades från odlingskolven genom att använda trypsinliknande enzymer. Därefter inkuberades cellerna med antikroppar specifika för MSC-markörer (CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 och CD49b) och hematopoetiska (CD34, CD45 och CD14). Cytometrisk analys av expressionsmarkörerna visade att 100 % av cellerna som användes för transplantation i varje patient var MSC.

MSC differentieringsstudier. MSC:s multipotentiella differentieringskapacitet undersöktes genom att odla dessa celler i osteogena, kondrogena och adipogena differentieringsmedier, enligt en metod som liknar den tidigare beskrivna. I korthet lossades MSC:erna och såddes i odlingsplattor med 24 brunnar vid en celldensitet av 5x104 per brunn, varvid man fortsatte med att tillsätta motsvarande differentieringsmedium. För osteogen differentiering odlades MSC i närvaro av basalt medium berikat med dexametason (100 nM, Biotech), askorbinsyra (10 mM, Sigma), oorganiskt fosfat (1,8 mM, Merck) och beta-glycerolfosfat (2 mM, Sigma). För kondrogen differentiering odlades celler i ett kommersiellt medium för kondrocyter (Cell Application, USA) och för differentiering mot den adipogena härstamningen användes det kommersiella mediet NH Adipodiff Human (Miltenyi, USA). I samtliga fall hölls cellerna i odling i 21-28 dagar med mediumbyten var 4-5 dag. För att demonstrera förändringarna i samband med differentieringsprocessen fixerades cellerna med paraformaldehyd (Merck, USA) och specifika färgningar utfördes för varje fall. Kortfattat, alizarinrött för att detektera kalciumavlagring (bevis på osteogenes), Alcianblått för att detektera proteoglykaner (bevis på kondrogenes) och oljerött (oljerött) för att se lipider (bevis på adipogenes). I samtliga fall genomfördes mikroskopisk observation och fotografisk registrering. För endotelial differentiering (CEn) odlades EMF i MCDB 131-medium (Invitrogen, USA) berikat med 10 % autologt serum, 10 µg/ml human epidermal tillväxtfaktor (hu-EGF, FoU) och hydrokortison (1µg/ml, Sigma) .

MSC-implantation hos patienter med pulpa-nekros och apikal parodontit. Alla MSC-bearbetningsprocedurer kommer att utföras i renrummet på IVIC-cellterapienheten enligt standarderna för god tillverkningssed (GMP). Allogen BM-MSC från patienter diagnostiserade med posttraumatisk nonunion och behandlade med implantation av dessa celler kommer att användas för att inducera benregenerering. MSC som ska användas i detta protokoll har tidigare varit fenotypiskt och funktionellt karakteriserat. MSC kommer att tinas, odlas och expanderas som tidigare beskrivits. En del av cellerna kommer att hållas i ett medium för MSC, och en annan del kommer att odlas i endotelialt differentieringsmedium (CEM-Endo). När det erforderliga antalet MSC och MSC-Endo har uppnåtts, kommer en suspension av dessa celler (75 000 celler från var och en av dem) att placeras i sterila odlingsrör innehållande DMEM-F12 odlingsmedium, utan fenolrött, kompletterat med 20 % autologt serum. Varje rör som innehåller MSC / MSC-Endo kommer att transporteras i en liten biologisk provtransportkällare, vid rumstemperatur, till tandvården vid Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Under sterila förhållanden kommer patienten att lokalbedövas i det drabbade tandområdet; rotkanalen i den drabbade tanden kommer att exponeras och förberedas för att utföra MSC / MSC-Endo / PRP-implantatet. Samtidigt avlägsnas odlingsmediesupernatanten från varje rör och CEM/CEM-Endo "knappen (pellet)" återsuspenderas i autolog blodplättsrik plasma (PRP). Efter MSC/Endo/PRP-suspensionen tillsätts 5 % CaCl2 och trombin. Omedelbart, och innan koageln bildas, kommer 20 mikroliter av CEM / CEM-Endo / PRP-suspensionen att placeras i rotkanalen, täckt med ett kollagenmembran. Därefter kommer obturationsproceduren med biokeramer att utföras i nivå med massakammaren, jonomert glas för att skydda biokeramen och senare kompositharts för att återställa tanden.

Post-implantation klinisk utvärdering av EMF

1. Kliniska kontroller (ansiktsutvärdering, tandköttsutvärdering, apikal palpation, horisontella och vertikala slagverk, köld- och värmekänslighetstest) kommer att utföras på dagarna 0, 7, 30, 90, 180 och 364. Dessutom kommer en klinisk utvärdering att utföras två år efter implantation av EMC.
2. Radiologiska kontroller kommer att genomföras dag 0, 7, 30, 90, 180 och 364. Dessutom kommer de att utföras två år efter implantation av mesenkymala stromaceller.
3. En tomografisk utvärdering kommer att utföras när den periapikala reparationen kommer att vara uppenbar i en periapikal röntgenbild.