PNPLA3、TM6SF2、および MBOAT7 遺伝子変異体が非アルコール性脂肪肝疾患の治療成績に及ぼす影響。

この研究の目的は、PNPLA3 rs738409、TM6SF2 rs58542926、および MBOAT7 rs641738 が、303 mg のシリビン-リン脂質複合体による治療に対する、代謝パラメーター、肝臓損傷、および肝臓脂肪蓄積に関する NAFLD 患者の反応に影響を与えることができるかどうかを評価することでした 10。 mg のビタミン D、および 15 mg のビタミン E を 1 日 2 回、6 か月間。

研究者らは、体重、胴囲と身長の比 (WHtR)、血圧測定、体格指数 (BMI)、血糖値とインスリン、インスリン抵抗性評価のための恒常性モデル (HOMA-IR)、アスパラギン酸とアラニン アミノトランスフェラーゼ (AST、ALT)、ガンマ-グルタミル トランスフェラーゼ (GGT)、血球数、C 反応性タンパク質 (CRP)、チオバルビツール酸反応性物質 (TBARS)、肝臓の硬直、および 3 つの研究グループ間の制御された減衰パラメーター (CAP): NAFLD 野生型対照群 (n. 30)、NAFLD治療野生型群(n. 30)、NAFLD治療変異群(n. 32)。 オンラインランダム化ソフトウェアhttp://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfmを使用して、ブロックランダム化法を使用して、NAFLD野生型コントロールグループおよびNAFLD治療野生型患者の60人の変異していない患者をランダム化しました。

野生型対照群は、研究期間中にいかなる種類の治療も受けなかった PNPLA3、TM6SF2、および MBOAT7 変異のない NAFLD 患者によって構成されました。

NAFLD 治療野生型および NAFLD 治療突然変異群に挿入された患者は、303mg のシリビン-リン脂質複合体、10mg のビタミン D、および 15mg のビタミン E を 1 日 2 回、6 か月間経口投与されました。 登録された患者のうち、研究から脱落した患者はいなかった。

治療の最後に、WHtR、血圧測定、BMI、血糖値とインスリン、HOMA-IR、AST、ALT、GGT、血球数、CRP、TBARS、肝硬直、CAP の評価が再実行されました。 実験的観察中、患者は登録前の食生活に基づいて自由に食事をとっており、研究期間中はあらゆる種類の運動が推奨されていました。 食物摂取量は、コンピューター化されたソフトウェアを使用して、ベースラインと治療終了時の両方で評価されました。 調査員は、食事日誌を使用して、就業日と週末を含む完全な 1 週間の食物摂取量を記録しました。 消費される食物の量と質に基づいて、ソフトは毎日のエネルギー摂取量と多量栄養素のパーセンテージ/カロリー量を詳しく説明します. 身体運動の評価のために、研究者はベースライン時と治療終了時に、いくつかの簡単な質問を含む特定のアンケートを提出しました。 参加者は、過去 6 か月間で毎日の身体活動に変化がありましたか? 1: いいえ、2: はい。はいの場合、身体活動は強化または悪化しましたか? アルコール消費量は、治療の開始時と終了時に評価されました。 NAFLD の組織学的診断を受けた 102 人の患者に続いて、カンパニア大学の肝胃腸科部門「Luigi Vanvitelli は、2017 年 1 月から 10 月の間に、インフォームド コンセントに署名した後、PNPLA3 rs738409、TM6SF2 rs58542926、および MBOAT7 rs641738 遺伝子変異体についてスクリーニングされ、 32 人が研究の選択基準を満たし、PNPLA3 I148I/M、I148M/M、TM6SF2 167E/K、167K/K および MBOAT7 TMC4C/T または TMC4T/T 遺伝子変異体のうち少なくとも 1 つを示し、60 人と共に登録されました。変異のない患者。 10人の患者は、いくつかの併存疾患および/または肝硬変および/または肝細胞癌(HCC)などの進行期肝疾患の共存により、登録から除外されました。

NAFLD の有無の定義と病期分類は、肝生検、血清学的検査、および臨床データの収集によって評価されました。 病歴、アルコール消費量（AUDIT-C）、投薬、薬物乱用、喫煙習慣も調査されました。 血圧、体重、身長を直接測定し、WHtR を計算しました。 BMI は、体重 (kg) を身長 (m) の 2 乗で割ることによっても計算されました。 患者は、いくつかの生化学的パラメータを評価し、遺伝子分析を行うために、12時間の絶食後に末梢静脈血サンプル採取を受けました。

インスリン、GGT、CRP、レベルは、比色アッセイキット（Amplite 13801/13803およびThermo Fisher Scientific EIAGLUC）を使用して、市販のキット、AST、ALT、およびグルコースを使用して酵素的に測定しました。 HOMA-IR も次の式を使用して計算されました: 空腹時インスリン (μU/mL) × 血漿グルコース (mmol/L)/22.5。

FibroScan® トランジェント エラストグラフィ (TE) は、FibroScan® バージョン 502 (Echosens、パリ、フランス) と標準プローブ (M および XL プローブ) を使用して実行されました。 特大 (XL) プローブは、超音波検査で評価された皮膚から肝被膜までの距離が 2.5 cm を超えた場合、および/または BMI が 30 を超えた場合に使用されました。 FibroScan® は専門医によって実施され、最大試行回数を 20 に設定して、成功した肝臓剛性 (LS) 測定として定義される 10 の許容可能な測定値を取得しました。 Boursier らによって提案された基準。測定値を「非常に信頼できる」(IQR/M ≤ 0:1)、「信頼できる」(0:1 < IQR/M ≤ 0:3 または IQR/M > 0:3、LS 中央値 < 7:1) と見なすために使用されました。 kPa)、または「信頼性が低い」(IQR/M > 0:3、LS 中央値 ≥ 7:1 kPa)。 CAP のこれらのスコアに基づいて、調査員は登録患者を S0、脂肪症なし (0% ～ 10% 脂肪、0 ～ 237 dB/m) に分類しました。 S1、軽度の脂肪症 (脂肪 11% ～ 33%、238 ～ 259 dB/m)。 S2、中程度の脂肪症 (脂肪 34% ～ 66%、260 ～ 292 dB/m)。およびS3、TEに使用される超音波信号の減衰の計算によると、重度の脂肪症（> 67％の脂肪; ≥293 dB / m）。

TBARSアッセイは、10μlの血清を使用して実行されました。 クロモゲンＴＢＡＲＳは、標準として１，１，３，３－テトラメトキシプロファンを用いて５３２ｎｍの波長で分光光度計を使用して定量化した。 ＴＢＡＲＳの量は、タンパク質のｎｍｏｌ／μｇとして表した。 提示されたデータは、3 つの独立した実験から得られた平均 ± 標準偏差です。

末梢血サンプルからのゲノム DNA 抽出は、抽出キット PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen by Life Technologies、米国) を使用して実行されました。 各サンプルの DNA 量は、260 nm の波長を使用して分光光度計 (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) によって評価されました。 サンプル汚染の存在は、280 nm 波長評価を使用して評価され、260/280 比が 1.8 ～ 2 であったため、すべてのサンプルは良好な純度を示しました。多型の分析。

データバンク TM6SF2 rs58542926 (SNP 1)、MBOAT7 rs641738 (SNP2)、PNPLA3 rs738409 (SNP3) へのアクセス コードを使用した一塩基多型 (SNP) 分析は、TaqMan (Applied Biosystem) を使用した DNA ジェノタイピング リアルタイム PCR を使用して実行されました。 SNP 1 の場合は c_89463510_10、SNP 2 の場合は c_8716820_10、SNP 3 プローブの場合は c_7241_10。 すべての評価は、DNA PCR 増幅、対立遺伝子の同定、および融解曲線による終点分析の 3 段階で行われました。

第 1 段階は、TaqMan Universal PCR Master Mix に含まれる AmpliTaq Gold® DNA ポリメラーゼを使用して、SNP Genotyping Assay 40X に含まれる特定のプライマーと TaqMan® MGB プローブによってターゲット配列を増幅することによって行われました。対立遺伝子 1 の配列と、対立遺伝子 2 の配列を認識する蛍光色素 FAM™ でマークされた別のプローブ。各実験で 48 ウェル プレートを使用しました。サンプルの汚染によるエラーの可能性を避けるために、3 つの異なるネガティブ コントロールを分析しました。 各実験は三連で行った。 増幅は、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。 ジェノタイピング評価は、異なる蛍光色素で 5' にマークされた 2 つの MGB TaqMan® プローブを使用して、特定の遺伝子プライマーの異なる蛍光による対立遺伝子識別に基づいています。 VIC® の転送 C および FAM™ の T の SNIP2。 VIC® e G in FAM™ のフォワード C の SNIP3。 結果分析用ソフトウェア StepOne™2.0 使われた。 プローブからの蛍光を各ウェルのバックグラウンドで区別した後、結果を対立遺伝子識別プロットに投影する正規化されたシグナル強度 (Rn) を測定します。 ソフトウェアは、蛍光シグナルの位置に基づいてサンプルに特定の遺伝子型を与えます: 横軸 (対立遺伝子 1)、縦軸 (対立遺伝子 2)、対角軸 (対立遺伝子 1 と 2 の両方)。 他の 1 つの特定の蛍光の有病率は、両方のヘテロ接合体の存在とは対照的に、ホモ接合体の遺伝子型を特定しました。

統計分析 患者の数 (NAFLD 野生型対照群で 30 人、NAFLD 治療を受けた野生型で 30 人、NAFLD で治療された突然変異患者で 32 人) は、STATA-14® for mac- OS は、治療に対する HOMA-IR の反応における研究グループ間の予想差に基づいており、変異型グループと比較して、野生型グループの治療に対する患者の反応者が 2 倍であると仮定しています。 具体的には、研究者は、次の基準の少なくとも 1 つが対処された場合、患者のレスポンダーと見なしました。 HOMA-IR の正規化 (

統計分析は、社会科学統計プログラム (SPSS®) vs.18.0 を使用して実行されました。