Effect van genetische varianten van PNPLA3, TM6SF2 en MBOAT7 op het therapeutische resultaat van niet-alcoholische leververvetting.

Het doel van deze studie was om te evalueren of de PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 en MBOAT7 rs641738 de respons van NAFLD-patiënten met betrekking tot metabole parameters, leverbeschadiging en hepatische vetophoping zouden kunnen beïnvloeden op een behandeling met 303 mg silybine-fosfolipidencomplex, 10 mg vitamine D en 15 mg vitamine E tweemaal daags gedurende zes maanden.

De onderzoekers voerden een basislijnvergelijking uit van gewicht, taille-tot-hoogteverhouding (WHtR), bloeddrukmeting, body mass index (BMI), bloedglucose en insuline, het homeostatische model voor beoordeling van insulineresistentie (HOMA-IR), aspartaat en alanine aminotransferase (AST, ALT), gamma-glutamyl transferase (GGT), bloedbeeld, C-reactief proteïne (CRP), de Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS), leverstijfheid en gecontroleerde verzwakkingsparameter (CAP) tussen de drie onderzoeksgroepen: NAFLD wildtype controlegroep (n. 30), met NAFLD behandelde wildtype groep (n. 30), met NAFLD behandelde gemuteerde groep (n. 32). De blokrandomisatiemethode werd gebruikt om de 60 niet-gemuteerde patiënten in de NAFLD-wildtype-controlegroep en met NAFLD behandeld wildtype één te randomiseren, met behulp van de online randomisatiesoftware http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

De wild-type controlegroep was samengesteld uit NAFLD-patiënten zonder PNPLA3-, TM6SF2- en MBOAT7-mutaties die tijdens de onderzoeksperiode geen enkele vorm van behandeling kregen.

De patiënten die werden ingebracht in de met NAFLD behandelde wildtype en met NAFLD behandelde gemuteerde groepen werden onderworpen aan een orale toediening van 303 mg silybine-fosfolipidencomplex, 10 mg vitamine D en 15 mg vitamine E, tweemaal daags gedurende zes maanden. Geen van de ingeschreven patiënten stopte met het onderzoek.

Aan het einde van de behandeling werd de beoordeling van WHtR, bloeddrukmeting, BMI, bloedglucose en insuline, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, bloedbeeld, CRP, TBARS, leverstijfheid en CAP opnieuw uitgevoerd. Tijdens de experimentele observatie volgden de patiënten een gratis dieet op basis van hun voedingsgewoonten vóór de inschrijving en elke vorm van lichaamsbeweging werd aanbevolen tijdens de onderzoeksperiode. De voedselinname werd zowel aan het begin als aan het einde van de behandeling geëvalueerd met behulp van geautomatiseerde software. De onderzoekers registreerden met een voedingsdagboek de voedselinname van een volledige week, inclusief werkdagen en het weekend. Op basis van de hoeveelheden en kwaliteiten van het geconsumeerde voedsel, werkt de soft de dagelijkse energie-inname en het percentage/calorische hoeveelheid macronutriënten uit. Voor de beoordeling van de lichaamsbeweging dienden de onderzoekers een specifieke vragenlijst in bij aanvang en einde van de behandeling met enkele eenvoudige vragen: Doet de deelnemer of heeft de deelnemer ooit (in de afgelopen twee jaar) aan sport gedaan op een continue en regelmatige manier? Heeft de deelnemer de afgelopen zes maanden zijn/haar dagelijkse fysieke activiteit veranderd? 1: nee, 2: ja; zo ja, is de fysieke activiteit toegenomen of verslechterd? Het alcoholgebruik werd aan het begin en aan het einde van de behandeling beoordeeld. Honderdtwee patiënten met histologische diagnose van NAFLD, gevolgd door de Hepatogastroenterology Division van de Universiteit van Campania "Luigi Vanvitelli, werden tussen januari en oktober 2017 gescreend, na ondertekening van een geïnformeerde toestemming, voor de PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 en MBOAT7 rs641738 genetische varianten en tweeëndertig voldeden aan de inclusiecriteria voor het onderzoek en toonden dat ten minste één van de genetische varianten PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K en MBOAT7 TMC4C/T of TMC4T/T samen met zestig patiënten zonder de mutaties. Tien patiënten werden uitgesloten van deelname vanwege het naast elkaar bestaan ​​van verschillende comorbiditeiten en/of leverziekte in een gevorderd stadium, zoals cirrose en/of hepatocellulair carcinoom (HCC).

De definitie van de aanwezigheid/afwezigheid van NAFLD en de stadiëring werden beoordeeld door het uitvoeren van een leverbiopsie, serologische tests en het verzamelen van klinische gegevens. Medische geschiedenis, alcoholgebruik (AUDIT-C), medicijnen, drugsmisbruik, rookgewoonten werden ook onderzocht. Bloeddruk, gewicht, lengte werden direct gemeten en WHtR werd berekend. BMI werd ook berekend door het gewicht (kg) te delen door het kwadraat van de lengte (m). De patiënten werden na 12 uur vasten onderworpen aan perifere veneuze bloedmonsters om enkele biochemische parameters te evalueren en de genetische analyse uit te voeren.

Insuline-, GGT-, CRP-niveaus werden enzymatisch gemeten met behulp van in de handel verkrijgbare kits, AST, ALT en glucose met behulp van een colorimetrische testkit (Amplite 13801/13803 en Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR werd ook berekend met de formule: nuchtere insuline (μU/ml) x plasmaglucose (mmol/L)/22,5.

FibroScan® voorbijgaande elastografie (TE) werd uitgevoerd met behulp van de FibroScan® versie 502 (Echosens, Parijs, Frankrijk) met standaardsondes (M- en XL-sondes. De extra grote (XL) sonde werd gebruikt wanneer de afstand van de huid tot het leverkapsel, bepaald door middel van echografie, groter was dan 2,5 cm en/of wanneer de BMI >30 was. FibroScan® is uitgevoerd door een deskundige arts die tien acceptabele metingen heeft verkregen, gedefinieerd als een succesvolle meting van de leverstijfheid (LS), met een maximaal aantal pogingen van 20. De criteria voorgesteld door Boursier et al. werden gebruikt om de meting als "zeer betrouwbaar" (IQR/M ≤ 0:1), "betrouwbaar" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 of IQR/M > 0:3 met LS mediaan < 7:1 kPa), of "slecht betrouwbaar" (IQR/M > 0:3 met LS mediaan ≥ 7:1 kPa). Op basis van deze CAP-scores classificeerden de onderzoekers de ingeschreven patiënten in S0, geen steatose (0%-10% vet; 0-237 dB/m); S1, milde steatose (11%-33% vet; 238-259 dB/m); S2, matige steatose (34%-66% vet; 260-292 dB/m); en S3, ernstige steatose (>67% vet; ≥293 dB/m) in overeenstemming met berekening van de verzwakking van ultrasone signalen gebruikt voor TE.

De TBARS-test werd uitgevoerd met 10 μl serum. De cromogeen TBARS werd gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 532 nm met 1,1,3,3-tetramethoxypropaan als standaard. De hoeveelheid TBARS werd uitgedrukt als nmol/μg eiwit. Gepresenteerde gegevens zijn de gemiddelde ± standaarddeviatie, resulterend uit drie onafhankelijke experimenten.

De genomische DNA-extractie uit perifere bloedmonsters werd uitgevoerd met behulp van de extractiekit PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen van Life Technologies, VS). De hoeveelheid DNA van elk monster werd beoordeeld met een spectrofotometer (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) met een golflengte van 260 nm. De aanwezigheid van monsterverontreiniging werd beoordeeld door gebruik te maken van een 280 nm golflengte-evaluatie en al het monster vertoonde een goede mate van zuiverheid omdat de verhouding 260/280 tussen 1,8 en 2 lag. de analyse van de polymorfismen.

De analyse van single nucleotide polymorphisms (SNP's), met behulp van de toegangscode tot de databank TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), werd uitgevoerd met behulp van de DNA-genotypering RealTime PCR met TaqMan (Applied Biosystem) c_89463510_10 voor SNP 1, c_8716820_10 voor SNP 2, c_7241_10 voor SNP 3-sondes. Alle evaluaties werden uitgevoerd in drie fasen: DNA-PCR-amplificatie, allelidentificatie en eindpuntanalyse met smeltkromme.

De eerste fase werd gedaan met behulp van de AmpliTaq Gold® DNA-polymerase in de TaqMan Universal PCR Master Mix, waarbij de doelsequentie werd geamplificeerd door specifieke primers in de SNP Genotypering Assay 40X samen met TaqMan® MGB-probes: één gemarkeerd met fluorochroom VIC® die de sequentie van allel 1 en een andere probe gemarkeerd met fluorochroom FAM™ die de sequentie van allel 2 herkennen. Voor elk experiment werd een plaat met 48 putjes gebruikt, waarin een deel van de biologische monsters van onbekend genotype voor de SNP-analyse, er werden drie verschillende negatieve controles geanalyseerd om mogelijke fouten als gevolg van verontreiniging van monsters te voorkomen. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd. De amplificaties werden uitgevoerd met behulp van het StepOne™ Real Time PCR-systeem (Applied Biosystems). De genotyperingsbeoordeling is gebaseerd op de allelische discriminatie dankzij een verschillende fluorescentie van de specifieke genprimer, met behulp van twee MGB TaqMan®-sondes, gemarkeerd op 5' met een ander fluorochroom: SNP1 in omgekeerde G in VIC® en A in FAM™; SNIP2 in voorwaartse C in VIC® en T in FAM™; SNIP3 in voorwaartse C in VIC® en G in FAM™. Voor de resultatenanalyse is de software StepOne™2.0 was gebruikt. Na de differentiatie van de fluorescentie van de sondes naar de achtergrond in elk putje, meet het de genormaliseerde signaalintensiteiten (Rn) en projecteert de resultaten in een allelische discriminatieplot. De software geeft de monsters een specifiek genotype op basis van de positie van het fluorescentiesignaal: horizontale as (allel één), verticale as (allel 2) diagonale as (zowel allel één als twee). De prevalentie van een specifieke fluorescentie op de andere identificeerde het homozygose genotype, integendeel de aanwezigheid van beide heterozygose.

Statistische analyse Het aantal patiënten (30 in de NAFLD-wildtype-controlegroep, 30 in de met NAFLD behandelde wildtype en 32 in met NAFLD behandelde gemuteerde patiënten) werd berekend met behulp van de kracht- en steekproefomvangberekeningsfunctie van STATA-14® voor mac- OS, op basis van een verwacht verschil tussen de onderzoeksgroepen in de respons van de HOMA-IR op de therapie, uitgaande van een dubbele hoeveelheid patiënten die op de therapie reageren in de wildtypegroep in vergelijking met de gemuteerde groep. Concreet beschouwden de onderzoekers de patiënt als responder als aan ten minste een van de volgende criteria was voldaan: normalisatie van de HOMA-IR (

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0.