PNPLA3、TM6SF2 和 MBOAT7 遗传变异对非酒精性脂肪性肝病治疗结果的影响。

本研究的目的是评估 PNPLA3 rs738409、TM6SF2 rs58542926 和 MBOAT7 rs641738 是否会影响 NAFLD 患者对代谢参数、肝损伤和肝脂肪堆积的反应，使用 303 mg 水飞蓟宾-磷脂复合物进行治疗，10毫克的维生素 D 和 15 毫克的维生素 E，每天两次，持续六个月。

研究人员对体重、腰围身高比 (WHtR)、血压测量、体重指数 (BMI)、血糖和胰岛素、胰岛素抵抗评估稳态模型 (HOMA-IR)、天冬氨酸和丙氨酸氨基转移酶（AST、ALT）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、血细胞计数、C反应蛋白（CRP）、硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）、肝脏硬度和控制衰减参数（CAP）在三个研究组中： NAFLD 野生型对照组（n. 30), NAFLD 治疗野生型组 (n. 30), NAFLD 治疗突变组 (n. 32). 使用在线随机化软件 http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm，采用区组随机化方法将 NAFLD 野生型对照组和 NAFLD 治疗野生型组中的 60 名未突变患者随机化。

野生型对照组由在研究期间未接受任何类型治疗的无 PNPLA3、TM6SF2 和 MBOAT7 突变的 NAFLD 患者组成。

插入 NAFLD 治疗野生型和 NAFLD 治疗突变组的患者接受了 303mg 水飞蓟宾-磷脂复合物、10mg 维生素 D 和 15mg 维生素 E 的口服给药，每天两次，持续六个月。 所有入选患者均未退出研究。

治疗结束时，重新进行WHtR、血压测量、BMI、血糖和胰岛素、HOMA-IR、AST、ALT、GGT、血细胞计数、CRP、TBARS、肝硬度和CAP的评估。 实验观察期间，患者在入组前饮食习惯的基础上自由饮食，研究期间建议进行任何类型的体育锻炼。 使用计算机化软件在基线和治疗结束时评估食物摄入量。 调查人员用饮食日记记录了整个一周的食物摄入量，包括工作日和周末。 根据消耗的食物的数量和质量，软件阐述了每日能量摄入量和常量营养素的百分比/热量。 对于体育锻炼评估，研究人员在基线和治疗结束时提交了一份特定的调查问卷，其中包含一些简单的问题：参与者是否（在过去两年中）以持续和规律的方式进行或曾经进行过运动？ 参与者在过去六个月内是否改变了他/她的日常身体活动？ 1：否，2：是；如果是，体力活动是增强了还是恶化了？ 在治疗开始和结束时评估饮酒量。 在签署知情同意书后，坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”肝胃肠病科对 12 名组织学诊断为 NAFLD 的患者进行了 PNPLA3 rs738409、TM6SF2 rs58542926 和 MBOAT7 rs641738 基因变异筛查，并于 2017 年 1 月至 10 月期间对32 人符合该研究的纳入标准，并显示 PNPLA3 I148I/M、I148M/M、TM6SF2 167E/K、167K/K 和 MBOAT7 TMC4C/T 或 TMC4T/T 基因变异中至少有一个，与 60 人一起入选没有突变的患者。 由于同时存在多种合并症和/或肝硬化和/或肝细胞癌 (HCC) 等晚期肝病，10 名患者被排除在入组之外。

通过进行肝活检、血清学测试和收集临床数据来评估是否存在 NAFLD 的定义和分期。 还调查了病史、饮酒 (AUDIT-C)、药物治疗、药物滥用、吸烟习惯。 直接测量血压、体重、身高并计算WHtR。 BMI 也是通过将体重 (kg) 除以身高 (m) 的平方来计算的。 患者在禁食 12 小时后接受外周静脉血样采集，以评估一些生化参数并进行基因分析。

胰岛素、GGT、CRP 水平使用市售试剂盒进行酶促测量，AST、ALT 和葡萄糖使用比色测定试剂盒（Amplite 13801/13803 和 Thermo Fisher Scientific EIAGLUC）进行测量。 还使用以下公式计算 HOMA-IR：空腹胰岛素 (μU/mL) × 血浆葡萄糖 (mmol/L)/22.5。

FibroScan® 瞬时弹性成像 (TE) 使用 FibroScan® 502 版（Echosens，巴黎，法国）和标准探头（M 和 XL 探头）进行。 当通过超声检查评估的皮肤到肝囊的距离超过 2.5 厘米和/或 BMI > 30 时，使用超大 (XL) 探头。 FibroScan® 由专家医师执行，获得十个可接受的测量值，定义为成功的肝脏硬度 (LS) 测量值，最大尝试次数设置为 20。 Boursier 等人提出的标准。用于考虑测量“非常可靠”（IQR/M ≤ 0:1）、“可靠”（0:1 < IQR/M ≤ 0:3 或 IQR/M > 0:3，LS 中值 < 7:1 kPa)，或“可靠性差”（IQR/M > 0:3，LS 中值 ≥ 7:1 kPa）。 根据 CAP 这些分数，研究人员将登记的患者分类为 S0，无脂肪变性（0%-10% 脂肪；0-237 dB/m）； S1，轻度脂肪变性（11%-33% 脂肪；238-259 dB/m）； S2，中度脂肪变性（34%-66% 脂肪；260-292 dB/m）； S3，严重脂肪变性（>67% 脂肪；≥293 dB/m），根据用于 TE 的超声信号衰减计算得出。

使用 10 μl 血清进行 TBARS 测定。 使用分光光度计在 532nm 波长下以 1,1,3,3-四甲氧基丙烷作为标准对色原 TBARS 进行定量。 TBARS 的量表示为 nmol/μg 蛋白质。 提供的数据是平均值±标准偏差，来自三个独立实验。

使用提取试剂盒PureLink Genomic DNA Kit（Invitrogen by Life Technologies，USA）从外周血样品中提取基因组DNA。 使用 260 nm 波长的分光光度计（NanoDrop Thermo Fisher Scientific）评估每个样品的 DNA 量。 通过使用 280 nm 波长评估来评估样品污染的存在，并且所有样品都显示出良好的纯度，因为 260/280 比率在 1.8 和 2 之间。提取的 DNA 然后储存在 -20°C 冰箱中直到多态性分析。

使用数据库 TM6SF2 rs58542926（SNP 1）、MBOAT7 rs641738（SNP2）、PNPLA3 rs738409（SNP3）的访问代码，使用 DNA 基因分型实时 PCR 和 TaqMan（应用生物系统）进行单核苷酸多态性 (SNP) 分析c_89463510_10 用于 SNP 1，c_8716820_10 用于 SNP 2，c_7241_10 用于 SNP 3 探针。 所有评估分三个阶段进行：DNA PCR 扩增、等位基因鉴定和使用熔解曲线的终点分析。

第一阶段是使用 TaqMan 通用 PCR 预混液中包含的 AmpliTaq Gold® DNA 聚合酶，通过 SNP Genotyping Assay 40X 中包含的特定引物以及 TaqMan® MGB 探针扩增目标序列：一个标有荧光染料 VIC® 的探针可识别等位基因 1 的序列和另一个标有识别等位基因 2 序列的荧光染料 FAM™ 的探针。对于每个实验，使用 48 孔板，其中，未知基因型的一部分生物样品用于 SNP 分析，分析了三种不同的阴性对照，以避免由于样品污染而可能出现的错误。 每个实验一式三份进行。 使用 StepOne™ 实时 PCR 系统（Applied Biosystems）进行扩增。 由于特定基因引物的不同荧光，基因分型评估基于等位基因区分，使用两个 MGB TaqMan® 探针，在 5' 处用不同的荧光染料标记：SNP1 在 VIC® 中的反向 G 和在 FAM™ 中的 A； SNIP2 正向 VIC® 中的 C 和 FAM™ 中的 T； VIC® 中正向 C 中的 SNIP3 e FAM™ 中的 G。 对于结果分析软件 StepOne™2.0 被使用了。 在将探针发出的荧光与每个孔中的背景进行区分后，它会测量归一化信号强度 (Rn)，将结果投射到等位基因鉴别图中。 该软件根据荧光信号位置为样品提供特定基因型：水平轴（等位基因一）、垂直轴（等位基因 2）对角轴（等位基因一和二）。 一种特异性荧光的普遍存在，另一种鉴定为纯合子基因型，反之则两者均存在杂合子。

统计分析 使用 STATA-14® for mac- OS，基于研究组之间 HOMA-IR 对治疗反应的预期差异，假设与突变组相比，野生型组的患者对治疗的反应者数量增加一倍。 具体而言，如果至少满足以下标准之一，研究人员就会认为患者有反应：HOMA-IR 正常化（

使用社会科学统计程序 (SPSS®) vs.18.0 进行统计分析。