Wpływ wariantów genetycznych PNPLA3, TM6SF2 i MBOAT7 na wyniki terapeutyczne niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby.

Celem pracy była ocena, czy PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 i MBOAT7 rs641738 mogą wpływać na odpowiedź pacjentów z NAFLD w zakresie parametrów metabolicznych, uszkodzenia wątroby i akumulacji tłuszczu w wątrobie, na leczenie 303 mg kompleksu sylibina-fosfolipidy, 10 mg witaminy D i 15 mg witaminy E dwa razy dziennie przez sześć miesięcy.

Badacze dokonali podstawowego porównania masy ciała, stosunku obwodu talii do wzrostu (WHtR), pomiaru ciśnienia krwi, wskaźnika masy ciała (BMI), poziomu glukozy i insuliny we krwi, homeostatycznego modelu oceny insulinooporności (HOMA-IR), asparaginianu i aminotransferazy alaninowej (AST, ALT), transferazy gamma-glutamylowej (GGT), morfologii krwi, białka C-reaktywnego (CRP), substancji reagującej z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), sztywności wątroby i parametru kontrolowanego osłabienia (CAP) wśród trzech grup badawczych: Grupa kontrolna NAFLD typu dzikiego (n. 30), grupa typu dzikiego leczona NAFLD (n. 30), grupa zmutowana leczona NAFLD (n. 32). Metodę randomizacji blokowej zastosowano do randomizacji 60 niezmutowanych pacjentów w grupie kontrolnej NAFLD typu dzikiego i leczonej NAFLD typu dzikiego, przy użyciu internetowego oprogramowania do randomizacji http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Grupa kontrolna typu dzikiego składała się z pacjentów z NAFLD bez mutacji PNPLA3, TM6SF2 i MBOAT7, którzy nie otrzymywali żadnego rodzaju leczenia w okresie badania.

Pacjentom włączonym do grupy leczonej NAFLD typu dzikiego i leczonej NAFLD zmutowanej podawano doustnie 303 mg kompleksu sylibina-fosfolipid, 10 mg witaminy D i 15 mg witaminy E, dwa razy dziennie przez sześć miesięcy. Żaden z włączonych pacjentów nie zrezygnował z badania.

Pod koniec leczenia ponownie wykonano ocenę WHtR, pomiar ciśnienia krwi, BMI, glikemię i insulinę, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, morfologię krwi, CRP, TBARS, sztywność wątroby i CAP. Podczas obserwacji eksperymentalnej pacjenci przed włączeniem do badania byli na diecie swobodnej na podstawie nawyków żywieniowych, aw okresie badania zalecano każdy rodzaj ćwiczeń fizycznych. Spożycie pokarmu oceniano zarówno na początku, jak i na końcu leczenia przy użyciu oprogramowania komputerowego. Badacze rejestrowali w dzienniku diety spożycie żywności przez cały tydzień, w tym dni robocze i weekend. Na podstawie ilości i jakości spożywanych pokarmów soft opracowuje dzienne spożycie energii oraz procentową/kaloryczną ilość makroskładników. W celu oceny wysiłku fizycznego badacze przesłali specjalny kwestionariusz na początku i na końcu leczenia, zawierający kilka prostych pytań: Czy uczestnik uprawia lub kiedykolwiek uprawiał (w ciągu ostatnich dwóch lat) sport w sposób ciągły i regularny? Czy uczestnik zmienił swoją codzienną aktywność fizyczną w ciągu ostatnich sześciu miesięcy? 1: nie, 2: tak; jeśli tak, czy aktywność fizyczna zwiększyła się czy pogorszyła? Oceniono spożycie alkoholu na początku i na końcu leczenia. Stu dwóch pacjentów z histologicznym rozpoznaniem NAFLD, a następnie przez Oddział Hepatogastroenterologii Uniwersytetu Campania „Luigi Vanvitelli”, w okresie od stycznia do października 2017 r., zostało przebadanych, po podpisaniu świadomej zgody, pod kątem wariantów genetycznych PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 i MBOAT7 rs641738 oraz trzydziestu dwóch spełniło kryteria włączenia do badania i wykazało co najmniej jeden spośród wariantów genetycznych PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K i MBOAT7 TMC4C/T lub TMC4T/T, zostało włączonych razem z sześćdziesięcioma pacjentów bez mutacji. Dziesięciu pacjentów zostało wykluczonych z badania ze względu na współistnienie kilku chorób współistniejących i/lub zaawansowanych stadiów choroby wątroby, takich jak marskość wątroby i/lub rak wątrobowokomórkowy (HCC).

Definicję obecności/nieobecności NAFLD oraz stopień zaawansowania oceniano wykonując biopsję wątroby, testy serologiczne i gromadząc dane kliniczne. Badano również historię medyczną, spożycie alkoholu (AUDIT-C), leki, nadużywanie narkotyków, palenie tytoniu. Bezpośrednio zmierzono ciśnienie krwi, wagę, wzrost i obliczono WHtR. BMI obliczono również dzieląc wagę (kg) przez wzrost (m) do kwadratu. Chorych po 12 godzinach na czczo skierowano na pobranie krwi z żył obwodowych w celu oceny niektórych parametrów biochemicznych oraz wykonania analizy genetycznej.

Poziomy insuliny, GGT, CRP mierzono enzymatycznie przy użyciu dostępnych w handlu zestawów, AST, ALT i glukozy przy użyciu zestawu do testów kolorymetrycznych (Amplite 13801/13803 i Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR obliczono również za pomocą wzoru: insulina na czczo (μU/ml) × glikemia w osoczu (mmol/l)/22,5.

Przejściową elastografię (TE) FibroScan® wykonano przy użyciu FibroScan® wersja 502 (Echosens, Paryż, Francja) ze standardowymi sondami (sondy M i XL). Sondę bardzo dużą (XL) stosowano, gdy odległość od skóry do torebki wątroby oceniana ultrasonograficznie przekraczała 2,5 cm i/lub gdy BMI wynosił >30. FibroScan® został wykonany przez lekarza biegłego, uzyskując dziesięć akceptowalnych pomiarów, zdefiniowanych jako pomyślny pomiar sztywności wątroby (LS), przy maksymalnej liczbie prób ustalonej na 20. Kryteria zaproponowane przez Boursiera i in. zastosowano do uznania pomiaru za „bardzo rzetelny” (IQR/M ≤ 0:1), „rzetelny” (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 lub IQR/M > 0:3 z medianą LS < 7:1 kPa) lub „słabo wiarygodne” (IQR/M > 0:3 z medianą LS ≥ 7:1 kPa). Na podstawie tych wyników w CAP badacze sklasyfikowali włączonych pacjentów do S0, bez stłuszczenia (0%-10% tłuszczu; 0-237 dB/m2); S1, łagodne stłuszczenie (11%-33% tłuszczu; 238-259 dB/m); S2, umiarkowane stłuszczenie (34%-66% tłuszczu; 260-292 dB/m); i S3, ciężkie stłuszczenie (>67% tłuszczu; ≥293 dB/m) zgodnie z obliczeniami tłumienia sygnałów ultradźwiękowych stosowanych w TE.

Test TBARS przeprowadzono stosując 10 μl surowicy. TBARS kromogenu oznaczono ilościowo stosując spektrofotometr przy długości fali 532 nm z 1,1,3,3-tetrametoksyprofanem jako standardem. Ilość TBARS wyrażono jako nmol/μg białka. Przedstawione dane to średnia ± odchylenie standardowe, wynikające z trzech niezależnych eksperymentów.

Ekstrakcję genomowego DNA z próbek krwi obwodowej przeprowadzono przy użyciu zestawu do ekstrakcji PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen firmy Life Technologies, USA). Ilość DNA w każdej próbce oceniono za pomocą spektrofotometru (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) stosując długość fali 260 nm. Obecność zanieczyszczenia próbki oceniono za pomocą oceny długości fali 280 nm i wszystkie próbki wykazały dobry stopień czystości, ponieważ stosunek 260/280 wynosił od 1,8 do 2. Wyekstrahowany DNA przechowywano następnie w zamrażarce w temperaturze -20°C do analiza polimorfizmów.

Analizę polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNPs) z wykorzystaniem kodu dostępu do banku danych TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3) przeprowadzono stosując genotypowanie DNA RealTime PCR z TaqMan (Applied Biosystem) c_89463510_10 dla SNP 1, c_8716820_10 dla SNP 2, c_7241_10 dla sond SNP 3. Wszystkie oceny przeprowadzono w trzech fazach: amplifikacja DNA PCR, identyfikacja alleli i analiza punktu końcowego z krzywą topnienia.

Pierwsza faza została wykonana przy użyciu polimerazy DNA AmpliTaq Gold® zawartej w TaqMan Universal PCR Master Mix amplifikacji sekwencji docelowej przez specyficzne startery zawarte w SNP Genotyping Assay 40X wraz z sondami TaqMan® MGB: jedną oznaczoną fluorochromem VIC®, który rozpoznaje sekwencję allelu 1 oraz drugą sondę oznaczoną fluorochromem FAM™ rozpoznającym sekwencję allelu 2. Do każdego eksperymentu użyto płytki 48-dołkowej, w której część próbek biologicznych o nieznanym genotypie do analizy SNP, przeanalizowano trzy różne kontrole negatywne, aby uniknąć ewentualnych błędów wynikających z zanieczyszczenia próbek. Każde doświadczenie wykonano w trzech powtórzeniach. Amplifikacje przeprowadzono przy użyciu systemu StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems). Ocena genotypowania opiera się na rozróżnieniu alleli dzięki różnej fluorescencji specyficznego startera genu, przy użyciu dwóch sond MGB TaqMan®, oznaczonych na 5' innym fluorochromem: SNP1 w odwrotnej kolejności G w VIC® i A w FAM™; SNIP2 w forward C w VIC® i T w FAM™; SNIP3 w forward C w VIC® i G w FAM™. Do analizy wyników wykorzystano oprogramowanie StepOne™2.0 zastosowano. Po zróżnicowaniu fluorescencji wykonanej z sond z tłem w każdej studzience, mierzy znormalizowane intensywności sygnału (Rn) wyświetlając wyniki na wykresie dyskryminacji alleli. Oprogramowanie nadaje próbkom określony genotyp na podstawie pozycji sygnału fluorescencyjnego: oś pozioma (allel jeden), oś pionowa (allel 2) oś ukośna (zarówno allel jeden, jak i dwa). Występowanie specyficznej fluorescencji na drugim identyfikowało genotyp homozygotyczny, natomiast obecność obu heterozygoz.

Analiza statystyczna Liczbę pacjentów (30 w grupie kontrolnej z NAFLD typu dzikiego, 30 w grupie z NAFLD typu dzikiego leczonej i 32 w grupie ze zmutowaną NAFLD) obliczono przy użyciu funkcji obliczania mocy i wielkości próby STATA-14® dla mac- OS, na podstawie oczekiwanej różnicy między badanymi grupami w odpowiedzi HOMA-IR na terapię, przy założeniu podwójnej liczby odpowiedzi pacjentów na terapię w grupie typu dzikiego w porównaniu z grupą zmutowaną. W szczególności badacze uznali pacjentów za odpowiadających na leczenie, jeśli spełniono co najmniej jedno z następujących kryteriów: normalizacja HOMA-IR (

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu Programu Statystycznego dla Nauk Społecznych (SPSS®) w wersji 18.0.