Effekt av genetiska varianter av PNPLA3, TM6SF2 och MBOAT7 på terapeutiskt resultat för icke-alkoholisk fettleversjukdom.

Syftet med denna studie var att utvärdera om PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 och MBOAT7 rs641738 kunde påverka svaret hos NAFLD-patienter angående metabola parametrar, leverskador och fettackumulering av levern, på en behandling med 303 mg-fosfos, 303 mg sillipin-, 1- och 303 mg. mg vitamin D och 15 mg vitamin E två gånger om dagen i sex månader.

Utredarna gjorde en baslinjejämförelse av vikt, midja-till-höjd-förhållande (WHtR), blodtrycksmätning, body mass index (BMI), blodsocker och insulin, den homeostatiska modellen för insulinresistensbedömning (HOMA-IR), aspartat och alaninaminotransferas (AST, ALT), gamma-glutamyltransferas (GGT), blodvärde, C-reaktivt protein (CRP), Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS), leverstelhet och kontrollerad dämpningsparameter (CAP) bland de tre studiegrupperna: NAFLD vildtypskontrollgrupp (n. 30), NAFLD-behandlad vildtypsgrupp (n. 30), NAFLD-behandlad muterad grupp (n. 32). Blockrandomiseringsmetoden användes för att randomisera de 60 icke-muterade patienterna i NAFLD-vildtypskontrollgruppen och NAFLD-behandlad vildtyp-1, med hjälp av onlinerandomiseringsmjukvaran http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Vildtypskontrollgruppen bestod av NAFLD-patienter utan PNPLA3-, TM6SF2- och MBOAT7-mutationer som inte fick någon typ av behandling under studieperioden.

Patienterna som infogats i de NAFLD-behandlade vildtyps- och NAFLD-behandlade muterade grupperna genomgick en oral administrering av 303 mg silybin-fosfolipidkomplex, 10 mg vitamin D och 15 mg vitamin E, två gånger om dagen under sex månader. Ingen av de inskrivna patienterna hoppade av studien.

I slutet av behandlingen återupptogs bedömningen av WHtR, blodtrycksmätning, BMI, blodsocker och insulin, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, blodvärde, CRP, TBARS, leverstelhet och CAP. Under den experimentella observationen gick patienterna på gratis diet på basis av kostvanor före inskrivningen och någon typ av fysisk träning rekommenderades under studieperioden. Matintaget utvärderades både vid baslinjen och slutet av behandlingen med hjälp av en datoriserad programvara. Utredarna registrerade, med en dietdagbok, matintaget för en hel vecka, inklusive arbetsdagar och helger. Baserat på mängden och kvaliteten på maten som konsumeras, utvecklar den mjuka det dagliga energiintaget och procenten/kalorimängden makronäringsämnen. För utvärderingen av fysisk träning lämnade utredarna in ett specifikt frågeformulär vid baslinjen och slutet av behandlingen med några enkla frågor: Utövar eller har deltagaren någonsin idrottat (under de senaste två åren) på ett kontinuerligt och regelbundet sätt? Har deltagaren ändrat sin dagliga fysiska aktivitet under de senaste sex månaderna? 1: nej, 2: ja; om ja, har den fysiska aktiviteten ökat eller förvärrats? Alkoholkonsumtion utvärderades i början och i slutet av behandlingen. Etthundratvå patienter med histologisk diagnos av NAFLD följt av Hepatogastroenterology Division vid University of Campania "Luigi Vanvitelli, mellan januari och oktober 2017 screenades, efter att ha undertecknat ett informerat samtycke, för PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 och M664AT 7rs genvarianter och M38542926 trettiotvå uppfyllde inklusionskriterierna för studien och visade att minst en bland PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K och MBOAT7 TMC4C/T eller TMC4T/T genetiska varianter, var inskrivna tillsammans med sextio patienter utan mutationerna. Tio patienter uteslöts från inskrivningen på grund av samexistensen av flera komorbiditeter och/eller avancerade stadier av leversjukdom, såsom cirros och/eller hepatocellulärt karcinom (HCC).

Definitionen av förekomst/frånvaro av NAFLD och stadieindelningen utvärderades genom att utföra en leverbiopsi, serologiska tester och samla in kliniska data. Medicinsk historia, alkoholkonsumtion (AUDIT-C), mediciner, drogmissbruk, rökvanor undersöktes också. Blodtryck, vikt, längd mättes direkt och WHtR beräknades. BMI beräknades också genom att dividera vikten (kg) med kvadraten på höjden (m). Patienterna genomgicks efter 12 timmars fasta till perifer venös blodprovtagning för att utvärdera vissa biokemiska parametrar och för att utföra den genetiska analysen.

Insulin, GGT, CRP, nivåer mättes enzymatiskt med användning av kommersiellt tillgängliga kit, AST, ALT och glukos med användning av kolorimetrisk analyssats (Amplite 13801/13803 och Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR beräknades också med formeln: fasteinsulin (μU/mL) × plasmaglukos (mmol/L)/22,5.

FibroScan® transient elastografi (TE) utfördes med användning av FibroScan® version 502 (Echosens, Paris, Frankrike) med standardsonder (M- och XL-sonder. Den extra stora (XL) sonden användes när avståndet från huden till leverkapseln, bedömt med ultraljud, översteg 2,5 cm och/eller när BMI var >30. FibroScan® utfördes av en expertläkare som erhöll tio acceptabla mätningar, definierade som en lyckad mätning av leverstelhet (LS), med det maximala antalet försök satt till 20. Kriterierna som föreslagits av Boursier et al. användes för att betrakta mätningen "mycket tillförlitlig" (IQR/M ≤ 0:1), "pålitlig" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 eller IQR/M > 0:3 med LS median < 7:1 kPa), eller "dåligt tillförlitlig" (IQR/M > 0:3 med LS median ≥ 7:1 kPa). På basis av dessa CAP-poäng klassificerade utredarna de inskrivna patienterna i S0, ingen steatos (0%-10% fett; 0-237 dB/m); S1, mild steatos (11%-33% fett; 238-259 dB/m); S2, måttlig steatos (34%-66% fett; 260-292 dB/m); och S3, svår steatos (>67% fett; ≥293 dB/m) i enlighet med beräkning av dämpningen av ultraljudssignaler som används för TE.

TBARS-analysen utfördes med 10 μl serum. Kromogenet TBARS kvantifierades med användning av en spektrofotometer vid en våglängd av 532 nm med 1,1,3,3-tetrametoxiprofan som standard. Mängden TBARS uttrycktes som nmol/μg protein. Presenterade data är medelvärdet ± standardavvikelsen, resulterande från tre oberoende experiment.

Den genomiska DNA-extraktionen från perifera blodprover utfördes med hjälp av extraktionssatsen PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen av Life Technologies, USA). DNA-mängden av varje prov utvärderades med spektrofotometer (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) med en våglängd på 260 nm. Förekomsten av provkontamination bedömdes genom att använda en våglängdsutvärdering på 280 nm och alla prover visade god renhetsgrad eftersom förhållandet 260/280 var mellan 1,8 och 2. Det extraherade DNA:t förvarades sedan i -20°C frys tills analysen av polymorfismerna.

Analysen av singelnukleotidpolymorfismer (SNP) med hjälp av åtkomstkoden till databanken TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), utfördes med hjälp av DNA Bio Tasystem med RealTime PCR (DNA Bio Tasystem) c_89463510_10 för SNP 1, c_8716820_10 för SNP 2, c_7241_10 för SNP 3-sonder. Alla utvärderingar gjordes i tre faser: DNA PCR-amplifiering, allelidentifiering och slutpunktsanalys med smältkurva.

Den första fasen gjordes genom att använda AmpliTaq Gold® DNA-polymeraset i TaqMan Universal PCR Master Mix som amplifierade målsekvensen med specifika primrar som ingår i SNP Genotyping Assay 40X tillsammans med TaqMan® MGB-prober: en märkt med fluorokrom VIC® som känner igen sekvensen för allel 1 och en annan sond märkt med fluorokrom FAM™ som känner igen sekvensen för allel 2. För varje experiment användes en platta med 48 brunnar, i vilken en del av de biologiska proverna av okänd genotyp för SNP-analysen, tre olika negativa kontroller analyserades för att undvika eventuella fel på grund av kontaminering av prover. Varje experiment utfördes i tre exemplar. Amplifieringarna utfördes med användning av StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems). Genotypbedömningen baseras på den alleliska diskrimineringen tack vare en annan fluorescens av den specifika genprimern, med användning av två MGB TaqMan®-prober, markerade vid 5' med en annan fluorokrom: SNP1 i omvänd G i VIC® och A i FAM™; SNIP2 i framåt C i VIC® och T i FAM™; SNIP3 i framåt C i VIC® e G i FAM™. För resultatanalysen programvaran StepOne™2.0 var använd. Efter differentieringen av fluorescensen gjord från proberna till bakgrunden i varje brunn, mäter den de normaliserade signalintensiteterna (Rn) som projicerar resultaten i alleldiskrimineringsdiagram. Programvaran ger proverna en specifik genotyp baserad på fluorescenssignalens position: horisontell axel (allel ett), vertikal axel (allel 2) diagonal axel (både allel ett och två). Prevalensen av en specifik fluorescens på den andra identifierade homozygosgenotypen, tvärtom närvaron av båda heterozygosen.

Statistisk analys Antalet patienter (30 i NAFLD-vildtypskontrollgruppen, 30 i NAFLD-behandlade vildtyp och 32 i NAFLD-behandlade muterade) beräknades med hjälp av kraft- och provstorleksberäkningsfunktionen för STATA-14® för mac- OS, på basis av en förväntad skillnad mellan studiegrupperna i svaret av HOMA-IR på terapin, förutsatt att en dubbel mängd patienter svarade på terapin i vildtypsgruppen jämfört med den muterade. Specifikt ansåg utredarna patientens svar om minst ett av följande kriterier togs upp: normalisering av HOMA-IR (

Statistiska analyser utfördes med hjälp av Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0.