A PNPLA3, TM6SF2 és MBOAT7 genetikai változatok hatása az alkoholmentes zsírmájbetegség terápiás kimenetelére.

A vizsgálat célja annak felmérése volt, hogy a PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 és MBOAT7 rs641738 befolyásolhatja-e a NAFLD-betegek válaszát a metabolikus paraméterek, a májkárosodás és a májzsír felhalmozódás tekintetében a 303 mg pholiszilibin-phos-komplexszel, mg D-vitamint és 15 mg E-vitamint naponta kétszer hat hónapig.

A kutatók összehasonlították a súly, a derékmagasság arány (WHtR), a vérnyomásmérés, a testtömeg-index (BMI), a vércukorszint és az inzulin, az inzulinrezisztencia felmérésének homeosztatikus modellje (HOMA-IR), az aszpartát és az inzulin kiindulási összehasonlítását. alanin-aminotranszferáz (AST, ALT), gamma-glutamil-transzferáz (GGT), vérkép, C-reaktív fehérje (CRP), tiobarbitursav-reaktív anyag (TBARS), májmerevség és kontrollált gyengítési paraméter (CAP) a három vizsgálati csoport közül: NAFLD vad típusú kontrollcsoport (n. 30), NAFLD-vel kezelt vad típusú csoport (n. 30), NAFLD-vel kezelt mutált csoport (n. 32). A blokk randomizációs módszert alkalmazták a 60 nem mutált beteg véletlenszerű besorolására a NAFLD vad típusú kontrollcsoportban és a NAFLD-vel kezelt vad típusú egyben, a http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm online randomizációs szoftver segítségével.

A vad típusú kontrollcsoportot PNPLA3, TM6SF2 és MBOAT7 mutációval nem rendelkező NAFLD betegek alkották, akik nem részesültek semmilyen kezelésben a vizsgálati időszak alatt.

A NAFLD-vel kezelt vad típusú és NAFLD-vel kezelt mutáns csoportokba helyezett betegek 303 mg szilibin-foszfolipid komplexet, 10 mg D-vitamint és 15 mg E-vitamint kaptak szájon át, naponta kétszer hat hónapon keresztül. A beiratkozott betegek egyike sem lépett ki a vizsgálatból.

A kezelés végén a WHtR, a vérnyomásmérés, a BMI, a vércukor és az inzulin, a HOMA-IR, az AST, az ALT, a GGT, a vérkép, a CRP, a TBARS, a májmerevség és a CAP mérését újra elvégeztük. A kísérleti megfigyelés során a betegek a beiratkozás előtt az étkezési szokások alapján szabad diétán voltak, és a vizsgálati időszakban bármilyen típusú testmozgás javasolt. A táplálékfelvételt mind a kiinduláskor, mind a kezelés végén számítógépes szoftver segítségével értékelték. A nyomozók étrendi naplóval rögzítették egy teljes hét táplálékfelvételét, beleértve a munkanapokat és a hétvégét is. Az elfogyasztott élelmiszerek mennyisége és minősége alapján a soft kidolgozza a napi energiabevitelt és a makrotápanyagok százalékos/kalóriamennyiségét. A testmozgás értékeléséhez a vizsgálók egy speciális kérdőívet küldtek be a kezelés kezdetén és végén, néhány egyszerű kérdéssel: Sportol-e, vagy sportol-e valaha (az elmúlt két évben) a résztvevő folyamatosan és rendszeresen? Változott-e a résztvevő napi fizikai aktivitásán az elmúlt hat hónapban? 1: nem, 2: igen; ha igen, a fizikai aktivitás fokozódott vagy romlott? Az alkoholfogyasztást a kezelés elején és végén értékelték. Százkét NAFLD szövettani diagnózisú beteget, majd a Campania Egyetem Hepatogastroenterológiai Osztálya, Luigi Vanvitelli 2017 januárja és októbere között szűrtek a PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 és MBOAT7 rs64173 rs64173 genetikai variánsokra, miután aláírták a beleegyező nyilatkozatot. harmincketten feleltek meg a vizsgálat bevonási kritériumainak, és a PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K és MBOAT7 TMC4C/T vagy TMC4T/T genetikai variánsok közül legalább egyet vettek be hatvannal együtt. mutációk nélküli betegek. Tíz beteget zártak ki a beiratkozásból több társbetegség és/vagy előrehaladott stádiumú májbetegség, például cirrhosis és/vagy hepatocellularis carcinoma (HCC) együttélése miatt.

A NAFLD jelenlétének/hiányának meghatározását és a stádium meghatározását májbiopsziával, szerológiai tesztekkel és klinikai adatok gyűjtésével értékelték. Vizsgálták a kórtörténetet, az alkoholfogyasztást (AUDIT-C), a gyógyszereket, a kábítószerrel való visszaélést, a dohányzási szokásokat is. Közvetlenül mértük a vérnyomást, testsúlyt, magasságot, és kiszámítottuk a WHtR-t. A BMI-t úgy is kiszámították, hogy a súlyt (kg) elosztottuk a magasság (m) négyzetével. A betegek 12 óra elteltével perifériás vénás vérmintavételen mentek keresztül bizonyos biokémiai paraméterek értékelése és a genetikai elemzés elvégzése érdekében.

Az inzulin-, GGT-, CRP-szinteket enzimatikusan mértük a kereskedelemben kapható készletek, AST, ALT és glükóz segítségével, kolorimetriás vizsgálati készlettel (Amplite 13801/13803 és Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). A HOMA-IR-t a következő képlettel is számítottuk: éhomi inzulin (μU/ml) × plazma glükóz (mmol/L)/22,5.

A FibroScan® tranziens elasztográfiát (TE) a FibroScan® 502-es verziójával (Echosens, Párizs, Franciaország) végeztük standard szondákkal (M és XL szondák). Az extra nagy (XL) szondát akkor használták, ha a bőr és a májkapszula közötti távolság ultrahangvizsgálattal meghaladta a 2,5 cm-t és/vagy ha a BMI >30 volt. A FibroScan® vizsgálatot egy szakértő orvos végezte el, tíz elfogadható mérési eredményt ért el, amelyeket sikeres májmerevség-mérésként (LS) határoztak meg, a kísérletek maximális számát 20-ban határozták meg. A Boursier és munkatársai által javasolt kritériumok. „nagyon megbízhatónak” (IQR/M ≤ 0:1), „megbízhatónak” (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 vagy IQR/M > 0:3 LS mediánnal < 7:1) használták a mérést. kPa), vagy "gyengén megbízható" (IQR/M > 0:3, LS medián ≥ 7:1 kPa). A CAP ezen pontszámok alapján a vizsgálók a beíratott betegeket S0, nem steatosis kategóriába sorolták (0%-10% zsír; 0-237 dB/m); S1, enyhe steatosis (11%-33% zsír; 238-259 dB/m); S2, mérsékelt steatosis (34%-66% zsír; 260-292 dB/m); és S3, súlyos steatosis (>67% zsír; ≥293 dB/m) a TE-hez használt ultrahangjelek csillapításának számítása szerint.

A TBARS vizsgálatot 10 μl szérum felhasználásával végeztük. A kromogén TBARS mennyiségét spektrofotométerrel határoztuk meg 532 nm hullámhosszon, standardként 1,1,3,3-tetrametoxi-propánt használva. A TBARS mennyiségét nmol/μg fehérje egységben fejeztük ki. A bemutatott adatok az átlag ± standard deviáció, három független kísérlet eredménye.

A perifériás vérminták genomiális DNS-kinyerését a PureLink Genomic DNA Kit extrakciós készlettel (Invitrogen by Life Technologies, USA) végeztük. Az egyes minták DNS mennyiségét spektrofotométerrel (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) határoztuk meg 260 nm hullámhosszon. A minta szennyezettségének meglétét 280 nm-es hullámhossz-értékeléssel határoztuk meg, és az összes minta jó tisztasági fokot mutatott, mivel a 260/280 arány 1,8 és 2 között volt. A kivont DNS-t ezután -20 °C-os fagyasztóban tároltuk. a polimorfizmusok elemzése.

Az egynukleotidos polimorfizmusok (SNP-k) analízisét a TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3) adatbankhoz való hozzáférési kód felhasználásával a DNS genotipizáló RealTime PCR (TaqMan) segítségével végeztük. c_89463510_10 SNP 1, c_8716820_10 SNP 2, c_7241_10 SNP 3 szondák. Valamennyi kiértékelés három fázisban történt: DNS PCR amplifikáció, allél azonosítás és végpont elemzés olvadási görbével.

Az első fázist a TaqMan Universal PCR Master Mixben található AmpliTaq Gold® DNS polimeráz felhasználásával végeztük, amely a célszekvenciát az SNP Genotyping Assay 40X-ben található specifikus primerekkel amplifikálta, a TaqMan® MGB próbákkal együtt: az egyiket fluorokróm VIC® jelzéssel, amelyek felismerik. az 1-es allél szekvenciáját és egy másik, a 2-es allél szekvenciáját felismerő, fluorokróm FAM™-mal jelölt szondát. Minden kísérlethez 48 lyukú lemezt használtunk, amelyen az SNP analízishez ismeretlen genotípusú biológiai minták egy részét, három különböző negatív kontrollt elemeztünk, hogy elkerüljük a minták szennyeződéséből adódó esetleges hibákat. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk. Az amplifikációkat a StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems) alkalmazásával végeztük. A genotipizálás értékelése a specifikus génprimer eltérő fluoreszcenciájának köszönhetően allélikus megkülönböztetésen alapul, két MGB TaqMan® próbát használva, amelyek 5'-nél különböző fluorokrómmal vannak megjelölve: SNP1 a fordított G-ben a VIC®-ben és A-ban a FAM™-ban; SNIP2 előrefelé C a VIC®-ben és T a FAM™-ban; SNIP3 az előre C-ben VIC®-ben és G-ben a FAM™-ban. Az eredmények elemzéséhez a StepOne™2.0 szoftvert használtunk. A szondákból származó fluoreszcencia és a háttér közötti differenciálása után minden lyukban méri a normalizált jelintenzitást (Rn), vetítve az eredményeket alléldiszkriminációs diagramon. A szoftver a mintáknak a fluoreszcencia jel pozíciója alapján meghatározott genotípust ad: vízszintes tengely (egyes allél), függőleges tengely (2. allél) átlós tengely (egyes és kettes allél egyaránt). A másikon egy specifikus fluoreszcencia prevalenciája azonosította a homozigózis genotípusát, éppen ellenkezőleg, mindkét heterozigózis jelenléte.

Statisztikai elemzés A betegek számát (30 a NAFLD vad típusú kontrollcsoportból, 30 a NAFLD-vel kezelt vad típusból és 32 a NAFLD-vel kezelt mutáns betegekből) a STATA-14® teljesítmény és mintaméret számítási függvénye segítségével számítottuk ki mac- OS, a vizsgált csoportok között a HOMA-IR terápiára adott válaszában mutatkozó várható különbség alapján, feltételezve, hogy a vad típusú csoportban dupla mennyiségű beteg reagál a terápiára a mutánshoz képest. A vizsgálók konkrétan akkor tekintették a betegeket reagálónak, ha a következő kritériumok közül legalább egy teljesült: a HOMA-IR normalizálása (

A statisztikai elemzéseket a Társadalomtudományi Statisztikai Program (SPSS®) vs.18.0 használatával végeztük.