Effekt af PNPLA3, TM6SF2 og MBOAT7 genetiske varianter på ikke-alkoholisk fedtleversygdom terapeutisk resultat.

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere, om PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 og MBOAT7 rs641738 kunne påvirke NAFLD-patienters respons med hensyn til metaboliske parametre, leverskader og leverfedtakkumulering, på en behandling med 303 mgphosphospho0 silids mg D-vitamin og 15 mg E-vitamin to gange dagligt i seks måneder.

Efterforskerne udførte en baseline sammenligning af vægt, talje-til-højde-forhold (WHtR), blodtryksmåling, body mass index (BMI), blodsukker og insulin, den homøostatiske model for insulinresistensvurdering (HOMA-IR), aspartat og alaninaminotransferase (AST, ALT), gamma-glutamyltransferase (GGT), blodtal, C-reaktivt protein (CRP), Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS), leverstivhed og kontrolleret svækkelsesparameter (CAP) blandt de tre undersøgelsesgrupper: NAFLD vildtype kontrolgruppe (n. 30), NAFLD-behandlet vildtypegruppe (n. 30), NAFLD-behandlet muteret gruppe (n. 32). Blokrandomiseringsmetoden blev brugt til at randomisere de 60 ikke-muterede patienter i NAFLD-vildtype-kontrolgruppen og NAFLD-behandlet vildtype-1 ved hjælp af online-randomiseringssoftwaren http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Vildtypekontrolgruppen var sammensat af NAFLD-patienter uden PNPLA3-, TM6SF2- og MBOAT7-mutationer, som ikke modtog nogen form for behandling i løbet af undersøgelsesperioden.

Patienterne indsat i de NAFLD-behandlede vildtype- og NAFLD-behandlede muterede grupper blev undergået en oral administration af 303 mg silybin-phospholipidkompleks, 10 mg D-vitamin og 15 mg E-vitamin, to gange dagligt i seks måneder. Ingen af ​​de indskrevne patienter droppede undersøgelsen.

Ved afslutningen af ​​behandlingen blev vurderingen af ​​WHtR, blodtryksmåling, BMI, Blodsukker og insulin, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, blodtal, CRP, TBARS, leverstivhed og CAP genudført. Under den eksperimentelle observation var patienterne på gratis diæt på basis af kostvaner før tilmeldingen, og enhver form for fysisk træning blev anbefalet i undersøgelsesperioden. Fødeindtagelse blev evalueret både ved baseline og slutningen af ​​behandlingen ved hjælp af en computerstyret software. Efterforskerne registrerede med en kostdagbog madindtaget for en hel uge, inklusive arbejdsdage og weekenden. På basis af mængden og kvaliteterne af indtaget mad, udarbejder den bløde det daglige energiindtag og procent/kaloriemængde af makronæringsstoffer. Til vurderingen af ​​fysisk træning indsendte efterforskerne et specifikt spørgeskema ved baseline og afslutning af behandlingen med nogle enkle spørgsmål: Dyrker eller har deltageren nogensinde dyrket (i de sidste to år) sport på en kontinuerlig og regelmæssig måde? Har deltageren ændret sin daglige fysiske aktivitet inden for de sidste seks måneder? 1: nej, 2: ja; hvis ja, er den fysiske aktivitet øget eller forværret? Alkoholforbruget blev vurderet ved begyndelsen og slutningen af ​​behandlingen. Et hundrede to patienter med histologisk diagnose af NAFLD efterfulgt af Hepatogastroenterology Division ved University of Campania "Luigi Vanvitelli, mellem januar og oktober 2017 blev screenet, efter at have underskrevet et informeret samtykke, for PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 og M6BOAT17rs og M644AT17rs og M644AT17rs varianter. 32 opfyldte inklusionskriterierne for undersøgelsen og viste, at mindst én blandt PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K og MBOAT7 TMC4C/T eller TMC4T/T genetiske varianter var tilmeldt sammen med 60 patienter uden mutationerne. Ti patienter blev udelukket fra optagelsen på grund af sameksistensen af ​​adskillige komorbiditeter og/eller fremskredne stadier af leversygdom, såsom cirrhose og/eller hepatocellulært karcinom (HCC).

Definitionen af ​​tilstedeværelse/fravær af NAFLD og stadieinddelingen blev vurderet ved at udføre en leverbiopsi, serologiske tests og indsamle kliniske data. Sygehistorie, alkoholforbrug (AUDIT-C), medicin, stofmisbrug, rygevaner, blev også undersøgt. Blodtryk, vægt, højde blev direkte målt, og WHtR blev beregnet. BMI blev også beregnet ved at dividere vægten (kg) med kvadratet af højden (m). Patienterne blev efter 12 timers hurtige indsamling af perifere venøse blodprøver gennemgået for at evaluere nogle biokemiske parametre og udføre den genetiske analyse.

Insulin-, GGT-, CRP-niveauer blev målt enzymatisk under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits, AST, ALT og glucose under anvendelse af kolorimetrisk assay-kit (Amplite 13801/13803 og Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR blev også beregnet ved hjælp af formlen: fastende insulin (μU/mL) × plasmaglucose (mmol/L)/22,5.

FibroScan® transient elastografi (TE) blev udført under anvendelse af FibroScan® version 502 (Echosens, Paris, Frankrig) med standardprober (M- og XL-prober). Den ekstra store (XL) sonde blev brugt, når afstanden fra huden til leverkapslen, vurderet ved ultralyd, oversteg 2,5 cm og/eller når BMI var >30. FibroScan® blev udført af en ekspert læge, der opnåede ti acceptable målinger, defineret som en vellykket måling af leverstivhed (LS), med det maksimale antal forsøg sat til 20. Kriterierne foreslået af Boursier et al. blev brugt til at betragte målingen som "meget pålidelig" (IQR/M ≤ 0:1), "pålidelig" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 eller IQR/M > 0:3 med LS median < 7:1 kPa), eller "dårligt pålidelig" (IQR/M > 0:3 med LS median ≥ 7:1 kPa). På basis af disse CAP-score klassificerede efterforskerne de indskrevne patienter i S0, ingen steatose (0%-10% fedt; 0-237 dB/m); S1, mild steatose (11%-33% fedt; 238-259 dB/m); S2, moderat steatose (34%-66% fedt; 260-292 dB/m); og S3, svær steatose (>67 % fedt; ≥293 dB/m) i overensstemmelse med beregning af dæmpningen af ​​ultralydssignaler anvendt til TE.

TBARS-assay blev udført med 10 μl serum. Kromogenet TBARS blev kvantificeret ved anvendelse af et spektrofotometer ved en bølgelængde på 532 nm med 1,1,3,3-tetramethoxyprophan som standard. Mængden af ​​TBARS blev udtrykt som nmol/μg protein. Præsenterede data er middelværdien ± standardafvigelse, som er et resultat af tre uafhængige eksperimenter.

Den genomiske DNA-ekstraktion fra perifere blodprøver blev udført ved at bruge ekstraktionssættet PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen af ​​Life Technologies, USA). DNA-mængden af ​​hver prøve blev vurderet med spektrofotometer (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) under anvendelse af en bølgelængde på 260 nm. Tilstedeværelsen af ​​prøvekontamination blev vurderet ved at bruge en 280 nm bølgelængdeevaluering, og alle prøverne viste god renhedsgrad, da 260/280-forholdet var mellem 1,8 og 2. Det ekstraherede DNA blev derefter opbevaret i -20°C fryser indtil analyse af polymorfismer.

Enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP'er)-analysen, ved hjælp af adgangskoden til databanken TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), blev udført ved brug af DNA Bio Tasystem med RealTime PCR (DNA Bio Tasystem) c_89463510_10 for SNP 1, c_8716820_10 for SNP 2, c_7241_10 for SNP 3-prober. Alle evalueringerne blev udført i tre faser: DNA PCR-amplifikation, allelidentifikation og slutpunktsanalyse med smeltekurve.

Den første fase blev udført ved at bruge AmpliTaq Gold® DNA-polymerase indeholdt i TaqMan Universal PCR Master Mix, der amplificerede målsekvensen med specifikke primere indeholdt i SNP Genotyping Assay 40X sammen med TaqMan® MGB-prober: en mærket med fluorochrom VIC®, der genkender sekvensen af ​​allel 1 og en anden probe markeret med fluorochrom FAM™, der genkender sekvensen af ​​allel 2. For hvert eksperiment blev der brugt en 48-brønds plade, hvor en del af de biologiske prøver af ukendt genotype til SNP-analysen, tre forskellige negative kontroller blev analyseret for at undgå mulige fejl på grund af kontaminering af prøver. Hvert eksperiment blev udført i tre eksemplarer. Amplifikationerne blev udført under anvendelse af StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems). Genotypevurderingen er baseret på den alleliske skelnen takket være en anderledes fluorescens af den specifikke genprimer, ved hjælp af to MGB TaqMan®-prober, markeret ved 5' med en anden fluorokrom: SNP1 i omvendt G i VIC® og A i FAM™; SNIP2 i fremad C i VIC® og T i FAM™; SNIP3 i fremad C i VIC® e G i FAM™. Til resultatanalysen er softwaren StepOne™2.0 var brugt. Efter differentieringen af ​​fluorescensen lavet fra proberne til baggrunden i hver brønd måler den de normaliserede signalintensiteter (Rn), der projicerer resultaterne i alleldiskriminationsplot. Softwaren giver prøverne en specifik genotype baseret på fluorescenssignalets position: vandret akse (allel 1), lodret akse (allel 2) diagonal akse (både allel 1 og 2). Forekomsten af ​​en specifik fluorescens på den anden identificerede homozygose-genotypen, tværtimod tilstedeværelsen af ​​både heterozygosen.

Statistisk analyse Antallet af patienter (30 i NAFLD-vildtypekontrolgruppen, 30 i den NAFLD-behandlede vildtype og 32 i NAFLD-behandlede muterede) blev beregnet ved hjælp af effekt- og prøvestørrelsesberegningsfunktionen i STATA-14® til mac- OS, på basis af en forventet forskel mellem undersøgelsesgrupperne i HOMA-IR's respons på terapien, idet der antages en dobbelt mængde patientresponder på terapien i vildtypegruppen sammenlignet med den muterede. Specifikt vurderede efterforskerne patientens responder, hvis mindst et af følgende kriterier blev behandlet: normalisering af HOMA-IR (

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0.