Vliv genetických variant PNPLA3, TM6SF2 a MBOAT7 na terapeutický výsledek nealkoholického ztučnění jater.

Cílem této studie bylo zhodnotit, zda PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 a MBOAT7 rs641738 mohou ovlivnit odpověď pacientů s NAFLD na metabolické parametry, poškození jater a hromadění tuku v játrech, na léčbu 303 mg komplexu silybin-fosfolipidy, 10 mg vitaminu D a 15 mg vitaminu E dvakrát denně po dobu šesti měsíců.

Výzkumníci provedli základní srovnání hmotnosti, poměru pasu k výšce (WHtR), měření krevního tlaku, indexu tělesné hmotnosti (BMI), glukózy v krvi a inzulínu, homeostatického modelu pro hodnocení inzulínové rezistence (HOMA-IR), aspartátu a alaninaminotransferáza (AST, ALT), gama-glutamyltransferáza (GGT), krevní obraz, C reaktivní protein (CRP), látka reaktivní s thiobarbiturovou kyselinou (TBARS), ztuhlost jater a parametr kontrolovaného atenuace (CAP) mezi třemi studijními skupinami: Kontrolní skupina divokého typu NAFLD (n. 30), skupina divokého typu léčená NAFLD (n. 30), mutovaná skupina léčená NAFLD (n. 32). Metoda blokové randomizace byla použita k randomizaci 60 nezmutovaných pacientů v kontrolní skupině divokého typu NAFLD a divoké skupině léčené NAFLD pomocí online randomizačního softwaru http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Kontrolní skupinu divokého typu tvořili pacienti s NAFLD bez mutací PNPLA3, TM6SF2 a MBOAT7, kteří během sledovaného období nedostali žádný typ léčby.

Pacientům zařazeným do skupin divokého typu léčených NAFLD a mutovaných skupin léčených NAFLD bylo perorálně podáváno 303 mg komplexu silybin-fosfolipid, 10 mg vitaminu D a 15 mg vitaminu E dvakrát denně po dobu šesti měsíců. Žádný ze zapsaných pacientů ze studie neodstoupil.

Na konci léčby bylo znovu provedeno hodnocení WHtR, měření krevního tlaku, BMI, glykémie a inzulinu, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, krevního obrazu, CRP, TBARS, jaterní ztuhlosti a CAP. Během experimentálního pozorování měli pacienti před zařazením do studie volnou dietu na základě dietních návyků a během období studie jim byl doporučován jakýkoli typ fyzického cvičení. Příjem potravy byl hodnocen jak na začátku, tak na konci léčby pomocí počítačového softwaru. Vyšetřovatelé zaznamenali dietním deníkem příjem potravy za celý týden, včetně pracovních dnů a víkendu. Na základě množství a kvality zkonzumovaného jídla soft vypracuje denní energetický příjem a procento/kalorické množství makroživin. Pro hodnocení fyzického cvičení výzkumníci předložili specifický dotazník na začátku a na konci léčby s několika jednoduchými otázkami: Dělal nebo dělal účastník někdy (v posledních dvou letech) sport kontinuálně a pravidelně? Změnil účastník za posledních šest měsíců svou každodenní fyzickou aktivitu? 1: ne, 2: ano; pokud ano, zvýšila se nebo zhoršila fyzická aktivita? Spotřeba alkoholu byla hodnocena na začátku a na konci léčby. Sto dva pacientů s histologickou diagnózou NAFLD následovaných hepatogastroenterologickým oddělením University of Campania „Luigi Vanvitelli, mezi lednem a říjnem 2017, bylo po podepsání informovaného souhlasu vyšetřeno na PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 a MBOAT78 rs64 genetické varianty třicet dva splnilo kritéria pro zařazení do studie a ukázalo se, že alespoň jedna z genetických variant PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K a MBOAT7 TMC4C/T nebo TMC4T/T byla zařazena spolu s šedesáti pacientů bez mutací. Deset pacientů bylo ze zařazení vyloučeno kvůli koexistenci několika komorbidit a/nebo pokročilého stádia onemocnění jater, jako je cirhóza a/nebo hepatocelulární karcinom (HCC).

Definice přítomnosti/nepřítomnosti NAFLD a staging byly hodnoceny provedením jaterní biopsie, sérologickými testy a sběrem klinických dat. Dále byla zkoumána anamnéza, konzumace alkoholu (AUDIT-C), léky, zneužívání drog, kuřácké návyky. Krevní tlak, hmotnost, výška byly přímo měřeny a byla vypočtena WHtR. BMI bylo také vypočteno vydělením hmotnosti (kg) druhou mocninou výšky (m). Pacientům byly po 12 hodinách nalačno odebrány vzorky periferní žilní krve za účelem vyhodnocení některých biochemických parametrů a provedení genetické analýzy.

Hladiny inzulínu, GGT, CRP byly měřeny enzymaticky pomocí komerčně dostupných souprav, AST, ALT a glukózy pomocí kolorimetrické testovací soupravy (Amplite 13801/13803 a Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR byla také vypočtena pomocí vzorce: inzulín nalačno (μU/ml) × plazmatická glukóza (mmol/l)/22,5.

FibroScan® přechodná elastografie (TE) byla provedena pomocí FibroScan® verze 502 (Echosens, Paříž, Francie) se standardními sondami (sondy M a XL). Extra velká (XL) sonda byla použita, když vzdálenost od kůže k játrovému pouzdru, hodnocená ultrasonograficky, přesáhla 2,5 cm a/nebo když BMI bylo >30. FibroScan® byl proveden odborným lékařem a získal deset přijatelných měření, definovaných jako úspěšné měření tuhosti jater (LS), s maximálním počtem pokusů nastaveným na 20. Kritéria navržená Boursierem a kol. byly použity k posouzení měření jako „velmi spolehlivé“ (IQR/M ≤ 0:1), „spolehlivé“ (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 nebo IQR/M > 0:3 s LS mediánem < 7:1 kPa), nebo „špatně spolehlivý“ (IQR/M > 0:3 s LS mediánem ≥ 7:1 kPa). Na základě těchto skóre vyšetřovatelé klasifikovali zařazené pacienty do S0, bez steatózy (0%-10% tuku; 0-237 dB/m); S1, mírná steatóza (11%-33% tuku; 238-259 dB/m); S2, střední steatóza (34%-66% tuku; 260-292 dB/m); a S3, těžká steatóza (>67 % tuku; ≥293 dB/m) v souladu s výpočtem zeslabení ultrazvukových signálů používaných pro TE.

Test TBARS byl proveden s použitím 10 μl séra. Kromogen TBARS byl kvantifikován pomocí spektrofotometru při vlnové délce 532 nm s 1,1,3,3-tetramethoxyprofanem jako standardem. Množství TBARS bylo vyjádřeno jako nmol/μg proteinu. Prezentovaná data jsou průměr ± standardní odchylka, vyplývající ze tří nezávislých experimentů.

Extrakce genomové DNA ze vzorků periferní krve byla provedena pomocí extrakční soupravy PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen by Life Technologies, USA). Množství DNA každého vzorku bylo hodnoceno spektrofotometrem (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) s použitím vlnové délky 260 nm. Přítomnost kontaminace vzorku byla hodnocena pomocí vyhodnocení vlnové délky 280 nm a všechny vzorky vykazovaly dobrý stupeň čistoty, protože poměr 260/280 byl mezi 1,8 a 2. Extrahovaná DNA byla poté skladována v mrazáku při -20 °C. analýza polymorfismů.

Analýza jednonukleotidových polymorfismů (SNP) s použitím přístupového kódu do databanky TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), byla provedena pomocí DNA genotypizace RealTime PCR s TaqsystemMan (Appli) c_89463510_10 pro SNP 1, c_8716820_10 pro SNP 2, c_7241_10 pro SNP 3 sondy. Všechna hodnocení byla provedena ve třech fázích: DNA PCR amplifikace, alelická identifikace a analýza koncového bodu s křivkou tání.

První fáze byla provedena pomocí DNA polymerázy AmpliTaq Gold® obsažené v TaqMan Universal PCR Master Mix, která amplifikovala cílovou sekvenci pomocí specifických primerů obsažených v SNP Genotyping Assay 40X spolu se sondami TaqMan® MGB: jedna označená fluorochromem VIC®, které rozpoznávají sekvence alely 1 a další sondy označené fluorochromem FAM™, které rozpoznávají sekvenci alely 2. Pro každý experiment byla použita 48jamková destička, ve které byla část biologických vzorků neznámého genotypu pro analýzu SNP, byly analyzovány tři různé negativní kontroly, aby se předešlo možným chybám způsobeným kontaminací vzorků. Každý experiment byl proveden trojmo. Amplifikace byly provedeny pomocí StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems). Posouzení genotypizace je založeno na alelické diskriminaci díky odlišné fluorescenci specifického genového primeru s použitím dvou sond MGB TaqMan®, označených na 5' odlišným fluorochromem: SNP1 inverzně G ve VIC® a A ve FAM™; SNIP2 v dopředném C ve VIC® a T v FAM™; SNIP3 v dopředném C ve VIC® a G ve FAM™. Pro analýzu výsledků software StepOne™2.0 byl použit. Po diferenciaci fluorescence vytvořené ze sond na pozadí v každé jamce změří normalizované intenzity signálu (Rn) promítající výsledky do grafu alelické diskriminace. Software dává vzorkům specifický genotyp na základě polohy fluorescenčního signálu: horizontální osa (alela jedna), vertikální osa (alela 2) úhlopříčná osa (jak alela jedna, tak i dvě). Převaha specifické fluorescence na druhé identifikovala genotyp homozygosy, naopak přítomnost obou heterozygoz.

Statistická analýza Počet pacientů (30 v kontrolní skupině divokého typu NAFLD, 30 u divokého typu léčeného NAFLD a 32 u mutovaných pacientů léčených NAFLD) byl vypočten pomocí funkce výpočtu síly a velikosti vzorku STATA-14® pro mac- OS na základě očekávaného rozdílu mezi studijními skupinami v odpovědi HOMA-IR na terapii, za předpokladu dvojnásobného počtu pacientů, kteří reagují na terapii ve skupině divokého typu ve srovnání s mutovanou skupinou. Konkrétně vyšetřovatelé považovali pacienty za odpovídající, pokud bylo řešeno alespoň jedno z následujících kritérií: normalizace HOMA-IR (

Statistické analýzy byly provedeny pomocí Statistického programu pro společenské vědy (SPSS®) vs.18.0.