Effekt av genetiske varianter av PNPLA3, TM6SF2 og MBOAT7 på ikke-alkoholisk fettleversykdom terapeutisk resultat.

Målet med denne studien var å evaluere om PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 og MBOAT7 rs641738 kunne påvirke responsen til NAFLD-pasienter med hensyn til metabolske parametere, leverskader og leverfettakkumulering, på en behandling med 303 mg sillipybin-,1-fosfo0 mg vitamin D, og ​​15 mg vitamin E to ganger daglig i seks måneder.

Etterforskerne utførte en baseline-sammenligning av vekt, midje-til-høyde-forhold (WHtR), blodtrykksmåling, kroppsmasseindeks (BMI), blodsukker og insulin, den homeostatiske modellen for insulinresistensvurdering (HOMA-IR), aspartat og alaninaminotransferase (AST, ALT), gamma-glutamyltransferase (GGT), blodtall, C-reaktivt protein (CRP), Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS), leverstivhet og kontrollert attenueringsparameter (CAP) blant de tre studiegruppene: NAFLD villtype kontrollgruppe (n. 30), NAFLD-behandlet villtypegruppe (n. 30), NAFLD-behandlet mutert gruppe (n. 32). Blokkrandomiseringsmetoden ble brukt til å randomisere de 60 ikke-muterte pasientene i NAFLD-villtypekontrollgruppen og NAFLD-behandlet villtype én, ved å bruke online randomiseringsprogramvaren http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Villtypekontrollgruppen var sammensatt av NAFLD-pasienter uten PNPLA3-, TM6SF2- og MBOAT7-mutasjoner som ikke mottok noen form for behandling i løpet av studieperioden.

Pasientene satt inn i NAFLD-behandlede villtype- og NAFLD-behandlede muterte grupper ble gjennomgått en oral administrering av 303 mg silybin-fosfolipidkompleks, 10 mg vitamin D og 15 mg vitamin E, to ganger daglig i seks måneder. Ingen av de registrerte pasientene droppet studien.

Ved avsluttet behandling ble vurderingen av WHtR, blodtrykksmåling, BMI, Blodsukker og insulin, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, blodtelling, CRP, TBARS, leverstivhet og CAP utført på nytt. Under den eksperimentelle observasjonen var pasientene på gratis diett på grunnlag av kostholdsvaner før påmeldingen og enhver form for fysisk trening ble anbefalt i løpet av studieperioden. Matinntak ble evaluert både ved baseline og slutten av behandlingen ved hjelp av en datastyrt programvare. Etterforskerne registrerte, med en diettdagbok, matinntaket for en hel uke, inkludert arbeidsdager og helger. På grunnlag av mengden og kvaliteten på maten som konsumeres, utdyper den myke det daglige energiinntaket og prosenten/kalorimengden av makronæringsstoffer. For vurderingen av fysisk trening sendte etterforskerne inn et spesifikt spørreskjema ved baseline og slutten av behandlingen med noen enkle spørsmål: Driver eller har deltakeren noen gang drevet (i de siste to årene) idrett på en kontinuerlig og regelmessig måte? Har deltakeren endret sin daglige fysiske aktivitet de siste seks månedene? 1: nei, 2: ja; hvis ja, har den fysiske aktiviteten økt eller forverret seg? Alkoholforbruk ble vurdert i begynnelsen og ved slutten av behandlingen. Ett hundre og to pasienter med histologisk diagnose av NAFLD etterfulgt av Hepatogastroenterology Division ved University of Campania "Luigi Vanvitelli, mellom januar og oktober 2017 ble screenet, etter å ha signert et informert samtykke, for PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 og M644AT17rs og M38542926 og M384AT17rs trettito oppfylte inklusjonskriteriene for studien og viste at minst én blant PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K og MBOAT7 TMC4C/T eller TMC4T/T genetiske varianter, ble registrert sammen med seksti pasienter uten mutasjonene. Ti pasienter ble ekskludert fra registreringen på grunn av sameksistens av flere komorbiditeter og/eller avanserte stadier av leversykdom som skrumplever og/eller hepatocellulært karsinom (HCC).

Definisjonen av tilstedeværelse/fravær av NAFLD og stadieinndelingen ble vurdert ved å utføre en leverbiopsi, serologiske tester og innsamling av kliniske data. Sykehistorie, alkoholforbruk (AUDIT-C), medisiner, narkotikamisbruk, røykevaner, ble også undersøkt. Blodtrykk, vekt, høyde ble direkte målt og WHtR ble beregnet. BMI ble også beregnet ved å dele vekten (kg) med kvadratet av høyden (m). Pasientene ble gjennomgått etter 12 timer fast til perifer venøs blodprøvetaking for å evaluere noen biokjemiske parametere og for å utføre den genetiske analysen.

Insulin, GGT, CRP, nivåer ble målt enzymatisk ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett, AST, ALT og glukose ved bruk av kolorimetrisk analysesett (Amplite 13801/13803 og Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR ble også beregnet ved hjelp av formelen: fastende insulin (μU/mL) × plasmaglukose (mmol/L)/22,5.

FibroScan® transient elastografi (TE) ble utført ved bruk av FibroScan® versjon 502 (Echosens, Paris, Frankrike) med standardprober (M- og XL-prober). Den ekstra store (XL) sonden ble brukt når avstanden fra huden til leverkapselen, vurdert ved ultralyd, oversteg 2,5 cm og/eller når BMI var >30. FibroScan® ble utført av en ekspertlege som oppnådde ti akseptable målinger, definert som en vellykket måling av leverstivhet (LS), med maksimalt antall forsøk satt til 20. Kriteriene foreslått av Boursier et al. ble brukt til å vurdere målingen som "svært pålitelig" (IQR/M ≤ 0:1), "pålitelig" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 eller IQR/M > 0:3 med LS median < 7:1 kPa), eller "dårlig pålitelig" (IQR/M > 0:3 med LS median ≥ 7:1 kPa). På grunnlag av CAP disse skårene, klassifiserte etterforskerne de registrerte pasientene i S0, ingen steatose (0%-10% fett; 0-237 dB/m); S1, mild steatose (11%-33% fett; 238-259 dB/m); S2, moderat steatose (34%-66% fett; 260-292 dB/m); og S3, alvorlig steatose (>67 % fett; ≥293 dB/m) i samsvar med beregning av demping av ultralydsignaler brukt for TE.

TBARS-analyse ble utført ved bruk av 10 μl serum. Kromogenet TBARS ble kvantifisert ved bruk av et spektrofotometer ved en bølgelengde på 532 nm med 1,1,3,3-tetrametoksypropan som standard. Mengden TBARS ble uttrykt som nmol/μg protein. Presenterte data er gjennomsnitt ± standardavvik, et resultat av tre uavhengige eksperimenter.

Den genomiske DNA-ekstraksjonen fra perifere blodprøver ble utført ved å bruke ekstraksjonssettet PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen av Life Technologies, USA). DNA-mengden av hver prøve ble vurdert med spektrofotometer (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) ved bruk av en bølgelengde på 260 nm. Tilstedeværelsen av prøvekontaminering ble vurdert ved å bruke en 280 nm bølgelengdeevaluering og alle prøvene viste god renhetsgrad på grunn av at 260/280-forholdet var mellom 1,8 og 2. DNA-ekstrahert ble deretter lagret i -20°C fryser til analysen av polymorfismene.

Enkeltnukleotidpolymorfismer (SNPs)-analysen, ved bruk av tilgangskoden til databanken TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), ble utført ved bruk av DNA-genotyping RealTime PCR (DNA Bio Tasystem) c_89463510_10 for SNP 1, c_8716820_10 for SNP 2, c_7241_10 for SNP 3-prober. Alle evalueringene ble gjort i tre faser: DNA PCR-amplifikasjon, allelidentifikasjon og endepunktsanalyse med smeltekurve.

Den første fasen ble utført ved å bruke AmpliTaq Gold® DNA-polymerase inneholdt i TaqMan Universal PCR Master Mix som amplifiserte målsekvensen med spesifikke primere inneholdt i SNP Genotyping Assay 40X sammen med TaqMan® MGB-prober: en merket med fluorokrom VIC® som gjenkjenner sekvensen til allel 1 og en annen probe merket med fluorokrom FAM™ som gjenkjenner sekvensen til allel 2. For hvert eksperiment ble det brukt en 48-brønns plate, der en del av de biologiske prøvene av ukjent genotype for SNP-analysen, tre ulike negative kontroller ble analysert for å unngå mulige feil på grunn av kontaminering av prøver. Hvert eksperiment ble utført i tre eksemplarer. Amplifikasjonene ble utført ved bruk av StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems). Genotypevurderingen er basert på alleldiskrimineringen takket være en annen fluorescens av den spesifikke genprimeren, ved bruk av to MGB TaqMan®-prober, merket på 5' med et annet fluorokrom: SNP1 i revers G i VIC® og A i FAM™; SNIP2 i fremover C i VIC® og T i FAM™; SNIP3 i fremover C i VIC® e G i FAM™. For resultatanalysen programvaren StepOne™2.0 var brukt. Etter differensieringen av fluorescensen laget fra probene til bakgrunnen i hver brønn, måler den de normaliserte signalintensitetene (Rn) som projiserer resultatene i alleldiskrimineringsplott. Programvaren gir prøvene en spesifikk genotype basert på fluorescenssignalposisjonen: horisontal akse (allel en), vertikal akse (allel 2) diagonal akse (både allel en og to). Prevalensen av en spesifikk fluorescens på den andre identifiserte homozygose-genotypen, tvert imot tilstedeværelsen av både heterozygosen.

Statistisk analyse Antall pasienter (30 i NAFLD-villtypekontrollgruppen, 30 i NAFLD-behandlet villtype og 32 i NAFLD-behandlede muterte) ble beregnet ved å bruke kraft- og prøvestørrelsesberegningsfunksjonen til STATA-14® for mac- OS, på grunnlag av en forventet forskjell mellom studiegruppene i responsen til HOMA-IR på terapien, forutsatt en dobbel mengde pasientresponder på terapien i villtypegruppen sammenlignet med den muterte. Spesifikt vurderte etterforskerne pasienten som responderer hvis minst ett av følgende kriterier ble adressert: normalisering av HOMA-IR (

Statistiske analyser ble utført ved bruk av Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0.